贺涓涓，洪华，杨世亮

(1中山大学附属第三医院康复医学科，广东 广州 510630;2中山大学附属第一医院神经内科，广东 广州 510080)

阿托伐他汀对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的保护作用*

贺涓涓1，洪华2△，杨世亮2

(1中山大学附属第三医院康复医学科，广东 广州 510630;2中山大学附属第一医院神经内科，广东 广州 510080)

目的:研究在脑缺血再灌注(ischemia－reperfusion，IR)损伤中阿托伐他汀对血脑屏障的保护作用及相关机制。方法:SD大鼠72只随机分为3组:假手术组、IR组和阿托伐他汀组。阿托伐他汀组大鼠术后予以阿托伐他汀(20 mg·kg－1·d－1)灌胃治疗，每天1次，连续3 d。利用线栓法制作脑IR模型，缺血2 h后再灌注72 h，对各组大鼠的神经功能进行评分，并检测梗死侧大脑半球脑组织含水量、伊文思蓝(Evans blue，EB)渗出量、紧密连接相关蛋白occludin和炎症因子磷脂酰肌醇3－激酶p110γ(PI3K－p110γ)的表达水平。结果:与假手术组相比，IR组大鼠脑组织含水量、EB的渗出量及神经功能评分均增加(P＜0.01)，同时occludin表达下降(P＜0.01)，PI3K－p110γ表达增加(P＜0.01);而阿托伐他汀治疗组大鼠脑水肿程度减轻(P＜0.01)，EB渗出量减少(P＜0.01)，occludin表达增加(P＜0.01)，PI3K－p110γ表达减少(P＜0.01)，神经功能评分下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:阿托伐他汀可以减轻脑IR损伤，可能与抑制炎症反应、增加紧密连接蛋白表达从而维持血脑屏障稳定性有关。

脑缺血再灌注;阿托伐他汀;血脑屏障

溶栓是缺血性脑卒中急性期治疗最有效的方法，但堵塞的血管再通后会引发再灌注损伤，表现为加重脑水肿、引起脑出血、损伤神经元等。脑缺血再灌注(ischemia－reperfusion，IR)损伤机制复杂，最主要是由于血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏，通透性增加，血管内的大分子物质及有害成分渗出到脑组织内［1］。微血管内皮细胞及细胞间的紧密连接(tight junction，TJ)构成BBB的主要结构，尤其是TJ可反映BBB通透性的改变［2］。目前对减轻脑IR损伤的药物研究较多，其中他汀类药物对缺血性脑卒中有比较明确的保护作用，作用机制涉及调节内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表达，减少自由基产生，减轻炎症反应等［3］，但是他汀类药物对脑IR损伤中BBB保护作用的研究尚未见报道。本文利用局灶性脑IR模型研究阿托伐他汀对BBB的保护作用，并对再灌注损伤中TJ相关蛋白occludin和炎症介质磷脂酰肌醇3－激酶p110γ(phosphatidylinositol3－kinase－p110γ，PI3K－p110γ)的变化进行研究。

材料和方法

1 实验分组与给药

由中山大学北校区实验动物中心提供的体重约230～270g的健康雄性SD大鼠72只，随机分为3组，每组24只，分别为假手术(sham，S)组、脑缺血再灌注(IR)组、阿托伐他汀(atorvastatin，A)组。阿托伐他汀组给药方法:阿托伐他汀钙片(辉瑞制药)溶于生理盐水，配成浓度为1 g/L的混悬液，按20 mg·kg－1·d－1的量于再灌注后1 h开始灌胃给药，每天1次，连续3 d。IR组建立IR模型，予以相同体积的生理盐水。

2 主要试剂

兔抗大鼠occludin抗体(Invitrogen);小鼠抗大鼠PI3K－p110γ抗体(Millipore);CY3标记的山羊抗兔Ⅱ抗(MultiSciences);辣根过氧化物酶标记的抗兔Ⅱ抗、辣根过氧化物酶标记的抗小鼠Ⅱ抗、ECL光化学显色试验盒(Cell Signaling)蛋白定量试验盒(Pierce)。

3 主要方法

3.1 IR造模方法采用改良的Kouzumi线栓法制备大鼠脑IR模型，缺血2 h后再灌注72 h。大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，分离并结扎左侧颈外动脉以防术中出血，分离左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)和颈内动脉(internal carotid artery， ICA)，并在CCA的近心端和远心端分别挂线以备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，结扎CCA近心端并在CCA近心端剪开一小口，将线头直径为(0.34± 0.02)mm的尼龙线栓(北京沙东生物技术有限公司)从剪口处顺着ICA方向插入，松开动脉夹前先将CCA远心端的挂线打一活结以防出血，继续往前插入线栓，确认线栓成功插入至大脑中动脉近端后再扎紧CCA远心端活结，缝合切口。线栓头端距颈总动脉分叉处约18～20 mm。缺血2 h后将线栓缓慢拨出约10 mm，使头端撤回至颈内动脉，实现再灌注。假手术组仅分离动脉，不行结扎缺血操作。

3.2 神经行为学评分参照经典的Zea Longa法进行评分。0分:无神经功能缺损;1分:对侧前肢不能完全伸展;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能活动，意识障碍。1～3分者纳为实验对象。经解剖发现蛛网膜下腔出血者不纳入实验。

3.3 脑组织含水量测定在大鼠脑缺血2 h再灌注72 h后处死，取出梗死侧大脑半球，先称湿重，再置于100℃烤箱内烤至恒重，称其干重，根据下列公式计算脑组织含水量:脑组织含水量=(湿重－干重) ÷湿重×100%。

3.4 伊文思蓝(evans blue，EB)渗出量测定生理盐水配制2.5%EB，按2 mL/kg的量于大鼠处死前1 h经股静脉给药，1 h后经左心室灌注生理盐水(2 mL/kg)，然后断头取脑，取出梗死侧大脑半球后先称重，而后放入甲酰胺溶液(0.1 mL/g)于60℃孵育24 h。在分光光度计上测定623 nm处已知不同浓度EB的吸光值(A)，根据标准曲线计算各组大鼠脑组织中EB含量。

3.5 免疫荧光法测定梗死灶周围occludin阳性血管计数脑缺血2 h再灌注72 h后将各组大鼠断头取脑，在视交叉前后1 cm处冠状取材，OTC包埋，冰冻切片机连续冠状切片，厚度为10 μm。加入兔抗大鼠occludin抗体(1∶100)，4℃过夜，第2天用0.01 mol/L的PBS冲洗3遍，并滴加CY3标记的山羊抗兔的Ⅱ抗，室温下孵育1 h，PBS冲洗3遍。每个脑取5张切片，每张切片取5个视野，Olympus BX51荧光显微镜下放大200倍观察梗死灶周围皮层中occludin阳性血管并计数，求其平均值。

3.6 Occludin和PI3K－p110γ蛋白表达的定量分析脑缺血2 h再灌注72 h后将各组大鼠断头取脑，冰上分离梗死侧大脑半球额顶区梗死灶皮质约100 mg，加入组织裂解液和蛋白酶抑制剂，研磨匀浆后离心，取上清液，测总蛋白浓度，并保存于－80℃。用BCA试剂盒测定总蛋白含量，每孔加样品总蛋白量100 μg，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白转至PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭1 h，分别加入兔抗大鼠occludin(1∶100)和小鼠抗大鼠PI3K－p110γ (1∶1000)的Ⅰ抗，4℃孵育过夜，第2天加入辣根过氧化物酶标记的抗兔Ⅱ抗和抗小鼠Ⅱ抗，室温孵育1 h，ECL光化学显色，拍片。以β－actin作为内参照，胶片经扫描仪扫描后获得图像测量分析并进行统计学处理。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0进行统计分析，所有资料均用均数±标准差(mean±SD)表示，正态分布资料的组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法;非正态分布资料的组间比较采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 脑缺血2 h再灌注72 h的病理改变

大鼠脑缺血2 h后再灌注72 h，与假手术组相比较，IR组的神经功能评分、脑组织含水量及EB渗出量明显增加(P＜0.01);伴有梗死灶周围occludin阳性血管计数下降(P＜0.01)、梗死灶皮层occludin表达下降(P＜0.01)及PI3K－p110γ表达增加(P＜0.01)，见图1、图2及表1。

2 阿托伐他汀治疗后BBB通透性的改变

再灌注72 h，阿托伐他汀治疗组大鼠脑组织含水量及EB渗出量均比IR组大鼠减少(P＜0.01)，梗死灶周围occludin阳性血管计数增加(P＜0.01)，而2组神经功能评分相比无统计学差异(P＞0.05)，见图1、表1。

表1 各组大鼠神经功能评分、梗死侧大脑半球脑组织含水量及EB含量、梗死灶周围occludin阳性血管计数的比较Table 1.Comparisons of neurological function scores，water and EB contents of brain tissue in ischemic hemisphere，and the numbers of occludin－positive vessels in ischemic boundary zone in different groups(Mean±SD)

＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs ischemia－reperfusion group.

3 各组大鼠梗死灶皮层occludin和PI3K-p110γ表达水平的变化

缺血2 h再灌注72 h，IR组大鼠occludin蛋白的表达量下降为假手术组的54.28%，PI3K－p110γ的表达量增加为假手术组的1.79倍;而使用阿托伐他汀治疗后，occludin蛋白的表达量较IR组增加，PI3K－p110γ的表达量较IR组下降，见图2。

讨论

TJ由多种TJ相关蛋白组成，如occludin、claudins、闭锁小带蛋白1(zonula occludens－1，ZO－1)等，大量研究表明脑缺血时TJ相关蛋白表达下降，分布改变［4］，相关机制主要涉及蛋白磷酸化、钙失调、氧化损伤、炎症反应等［5］。Occludin是很重要的一类跨膜蛋白，在脑微血管内皮上高度表达，有研究认为occludin的变化可反映TJ的完整性［6］。赵红等［7］对局灶性脑缺血(2 h)再灌注大鼠occludin蛋白表达变化的研究发现，与再灌注0 h相比，再灌注4 h、12 h、24 h、48 h和72 h occludin蛋白表达显著降低，以72 h为最明显。因此我们选择再灌注72 h作为观察时点。

我们发现，脑IR可导致BBB上occludin表达下降，伴随有炎症因子PI3K－p110γ表达增加;而使用阿托伐他汀治疗后occludin表达增加，PI3K－p110γ表达下降，与梗死侧大脑半球的脑水肿程度减轻、EB渗出减少一致，提示上调TJ相关蛋白的表达以及抑制炎症因子PI3K－p110γ的表达可能是阿托伐他汀保护BBB、减轻脑水肿的作用机制之一。另外我们观察到阿托伐他汀不仅能增强梗死灶皮层occludin蛋白的表达，也能增加梗死灶周围occludin阳性血管计数，说明阿托伐他汀对TJ的保护作用不仅限于缺血核心区，它还能增强缺血半暗带BBB的稳定性。

羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂——他汀类药物具有调节内皮功能、抗炎、抗氧化、稳定斑块及抑制血小板等多效作用［8］，但对调节BBB功能的研究尚少。在原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞，研究者发现匹伐他汀可上调TJ蛋白claudin－5的表达，增强内皮屏障的完整性［9］;在外伤性颅脑损伤动物模型，研究者发现辛伐他汀可增加claudin－5的表达并减少细胞间黏附分子的表达，减少白细胞渗出和脑水肿［10］。我们对大鼠脑IR模型的研究发现阿托伐他汀可增加occludin的表达，并降低PI3K－p110γ的表达，减轻脑水肿程度，改善神经功能评分，是对他汀类药物多效性研究的补充。此外，目前对他汀类药物脑保护作用的研究多在术前3 d或14 d开始予以他汀类药物预处理，我们的研究选择在大鼠脑IR发生后予以阿托伐他汀灌胃治疗，每天1次，连续3 d，更接近临床治疗模式，并且与现有临床研究结论一致:他汀类药物不仅对缺血性脑卒中有一级预防和二级预防作用，对急性脑卒中也有显著的神经保护作用［11－12］。

PI3Kγ是近来发现的与启动炎症反应、改变BBB通透性密切相关的一个因子，它由催化亚基p110和调节亚基p101、p84或p87组成，正常情况下脑组织内有少量表达，在脑缺血后表达量明显增加［13］。目前的研究发现PI3Kγ在介导炎症反应中起重要作用，与动脉粥样硬化及心脑血管事件密切相关相关［14］。对PI3K-p110γ基因敲除小鼠的研究发现PI3Kγ在脑缺血损伤中发挥重要作用，与野生型小鼠相比，PI3K-p110γ基因敲除小鼠的脑梗死体积和EB渗出明显减轻，紧密连接蛋白claudin－5和基底膜蛋白的表达增多，同时炎症因子基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)表达减少［15］。这提示PI3Kγ对BBB的通透性和TJ的调节起重要作用，可能成为卒中治疗的新靶点。但occludin与PI3Kγ表达的变化是否存在因果关系有待进一步研究。

综上所述，在脑IR损伤模型我们发现阿托伐他汀干预后，BBB通透性下降、脑水肿程度减轻、occludin蛋白表达增加而PI3K－p110γ表达减少，提示对于临床上有溶栓指针的患者，服用阿托伐他汀可保护BBB、减轻脑水肿。另外我们发现脑IR损伤导致大鼠神经功能评分增加，但使用阿托伐他汀治疗组大鼠神经功能评分下降无统计学意义，可能与本研究样本量较小，仅选择Zea Longa评分1～3分者纳入实验作为观察对象有关。

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Protective effect of atorvastatin on blood brain barrier in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury

HE Juan－juan1，HONG Hua2，YANG Shi－liang2

(1Department of Rehabilitation，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China;2Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:hhsums@126.com)

AIM:To explore the protective effects of atorvastatin on blood brain barrier(BBB)in cerebral ischemia－reperfusion(IR)injury and the potential mechanisms involved.METHODS:SD rats were divided into sham group，IR group and atorvastain group.Intraluminal suture method was used to establish cerebral IR model，and the ischemic brain was reperfused for 72 h after the occlusion.The rats in atorvastatin group were administered with atorvastatin(20 mg·kg－1·d－1)by gavage once a day for 3 consecutive days after operation.At 72 h after reperfusion，neurological function scores，the water content of the brain tissue，Evans blue(EB)content of ischemic hemisphere，the expression of tight junction(TJ)－associated protein occludin and inflammation factor phosphatidylinositiol 3－kinase－p110 gamma(PI3K－p110γ)were tested and analyzed.RESULTS:In IR group，the rats showed elevated neurological function scores(P＜0.01)，brain tissue water content(P＜0.01)and EB content(P＜0.01)，accompanied with the down－regulation of occludin expression(P＜0.01)and up－regulation of PI3K－p110γ(P＜0.01)at 72 h after reperfusion.Compared with IR group，decreased brain edema(P＜0.01)and EB leakage(P＜0.01)were observed in atorvastatin group，accompanied with increased occludin expression(P＜0.01)and decreased PI3K－p110γ expression(P＜0.01).However，no statistical difference of the neurological function scores between the 2 groups was observed.CONCLUSION:Atorvastain attenuates cerebral IR injury，which may be associated with the inhibition of inflammatory reactions and the up－regulation of TJ－associated proteins to maintain the stability of BBB.

Cerebral ischemia－reperfusion;Atorvastatin;Blood brain barrier

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.005

1000－4718(2015)02－219－05

2014－11－07

2014－12－29

国家自然科学基金资助项目(No.30971028);广东省自然科学基金资助项目(No.S2012010008539)

△通讯作者Tel:020－87331989;E－mail:hhsums@126.com