祝铁钢，孙金旭，朱会霞，葛晓楠，何新航，张宇豪

（河北衡水学院生命科学系，河北衡水053000）

灵芝是一种具有良好药性的真菌，自古以来一直被作为中药所使用，原因就在于灵芝在免疫力、护肝、降低血糖胆固醇、肿瘤防治等方面有明显的改良作用，免疫力方面，灵芝可以提高机体免疫力，增强机体的抵抗能力；保肝护肝方面，可以保护肝脏维持其正常解毒功能；血糖胆固醇方面，可以降低血糖和胆固醇防治糖尿病与脂肪肝等疾病；另外，灵芝在抗肿瘤方面也具有一定的功效[1-2]。1982年Kubota[3]首次从灵芝当中分离得到灵芝酸，但是国内灵芝酸的研究起步较晚，国内首次相关报道起始于陈国良[4]关于灵芝酸研究进展的综述。虽然，灵芝酸有良好的药用价值，但灵芝酸的产量较低。20世纪80年代，开始注重灵芝深层发酵代谢产物的生产以及其组成成分的研究[5]。

近年来关于灵芝酸的研究主要集中在分离纯化、化学结构和活性等方面[6]，但关于通过灵芝酸发酵条件优化来提高产量的研究较少，因此就灵芝酸发酵条件中的葡萄糖、酵母膏、VB1、温度、转速、装液量、误差进行了深入研究以提高灵芝酸的产量。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

灵芝，由衡水学院生物系微生物实验室提供。

95%乙醇，氯仿，NaHCO3，盐酸，乙酸，乙腈。

1.2 仪器

Agilent1100高效液相色谱：美国安捷伦有限公司；EV311旋蒸仪：莱伯泰科有限公司；JA1203电子天平：上海田宫称重制造有限公司。

1.3 样品等处理方法

1.3.1 灵芝酸标准液处理

准确秤取灵芝酸标准品10 mg，放入容积为100mL的容量瓶中，乙醇稀释至刻度，配置成浓度为1 mg/L的标准溶液，4℃冷藏备用。

1.3.2 灵芝酸的提取处理

适量秤取灵芝子实体，95%乙醇进行超声辅助提取，料液比例为 1∶20（mg/mL）；提取温度，70℃；浸提时间12 h，浸提后过滤，取滤液，真空薄膜旋蒸处理，真空浓缩至干，得到提取物浸膏，该浸膏用氯仿溶解，反复用水萃取5次，取氯仿层，过滤，取滤液，用饱和NaHCO3溶液萃取3次，取NaHCO3萃取层，3次用盐酸调节至溶液pH为2～3之间，取沉淀物，沉淀物用氯仿溶解，真空薄膜旋蒸处理，浓缩至干，得到粗灵芝酸。

1.4 HPLC测定条件[7]

HPLC法测定灵芝中灵芝酸产量条件为：色谱柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6×250 mm）；流动相为 2%乙酸：2%乙腈（体积比为 7∶3）；流速 0.3 mL/min；进样量10 μL外标法定量；柱温30℃；检测波长254 nm。

1.5 正交试验设计

选用葡萄糖、酵母膏、VB1、温度、转速、装液量和误差作为影响因素，各取3个水平，进行L18（37）正交试验，见表1。

表1 培养基优化正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for medium optimization

2 结果与讨论

灵芝在免疫力、护肝、降低血糖胆固醇、肿瘤防治等方面有明显的改良作用，因此，关于提高灵芝酸产量的研究也逐渐成为了科研热点之一，由于不同的发酵条件对灵芝酸产量有较大的影响，因此可以通过正交试验优化试验条件可以得出最佳因素组合，试验安排见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 灵芝酸发酵条件正交试验结果表Table 2 Results of orthogonal test for fermentation conditions optimization

表3 灵芝酸发酵条件正交试验方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization

由表2和表3可以得出培养基成分当中酵母膏差异显著、培养条件当中温度差异显著，说明酵母膏和温度两个因素对灵芝酸的产量影响显著；其中7个因素当中影响程度从大到小依次为酵母膏、温度、转速、葡萄糖、装液量、VB1和误差。对于3个不同水平比较而言，分别在 A2、B3、C3、D1、E2、F2、G2下灵芝酸产量最高。所以最佳试验方案为葡萄糖20 g/L，酵母膏1.5 g/L，VB10.02 mg/L，温度为 26℃，转速 150 r/min，装液量100mL/500mL。与金德宽[8]发表的灵芝酸工艺发酵条件的优化结果对比可以得出，转速均为150 r/min，装液量均为100 mL，试验结果一致，但在金德宽试验结果中温度为30℃，本试验结果温度为26℃，存在一定差异，但差异不显著；在A2B3C3D1E2F2G2下最高产量为1.68 g/L，未优化前灵芝酸产量为1.26 g/L，经过优化后产量增加0.42 g/L。另外在各试验组合中可以看出，各试验结果灵芝酸产量从大到小依次6＞12＞14＞18＞15＞ 3＞2＞ 11＞9 ＞4＞16＞17＞13＞ 7＞10 ＞1＞8＞5。

3 结论

以酵母膏、温度、转速、葡萄糖、装液量、VB1和误差为7个影响因素，以灵芝酸为目的产物设计了L18（37）正交试验，并进行相关的方差分析结果得出灵芝酸的适宜条件为：葡萄糖20g/L，酵母膏1.5g/L，VB10.02mg/L，温度为26℃，转速150 r/min，装液量100 mL/500 mL。

[1] 蒋婷婷.灵芝三萜类成分的研究进展[J].海峡药学,2012(1):1-2

[2] 杨锦生.灵芝主要化学成分及其药理作用研究述评[J].中华中医药学刊,2012(4):1-3

[3] Kubora T,Asaka Y,Miura I,et al.Structures of Ganoderic A and B,two new 1anostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum(Fr)Karst[J].Helv Chim Acta,1982,65(2):611-619

[4] 陈国良,陈晓清.灵芝有效成分研究综述[J].中国食用菌,1995,14(4):7-9

[5] 李民,陈长庆.重组大肠杆菌高密度发酵研究进展[J].生物工程进展,2000,20(2):26-30

[6] 林志彬.灵芝现代研究[M].北京:北京医科大学出版社,2001:21-25

[7] 鄢嫣,聂少平,陈奕.灵芝氯仿提取物的HPLC指纹图谱的研究[J].食品与生物技术学报,2009,28(5):589-593

[8] 金德宽.灵芝酸发酵工艺条件的优化[J].中国酿造,2011(9):1-6