于 颖, 陆 萌, 罗 瑶, 付佳琪, 林文和, 张 杰, 汪 红

(四川大学 生命科学学院生物科学实验教学中心, 四川 成都 610065)

微生物实验教学中开设蛭弧菌形态观察和动态观察实验研究

于 颖, 陆 萌, 罗 瑶, 付佳琪, 林文和, 张 杰, 汪 红

(四川大学 生命科学学院生物科学实验教学中心, 四川 成都 610065)

用硝酸银染色法对双层平板培养法获得的蛭弧菌进行染色,利用相差显微镜和CCD DP27数码成像系统观察并记录到蛭弧菌形态和侵入大肠杆菌的过程以及蛭弧菌鞭毛的运动状态。同时,通过提高蛭弧菌菌体浓度可观察到蛭弧菌捕捉大肠杆菌的动态过程。该实验让学生更加清晰和直观地观察到菌体的形态及运动方式,激发对微生物实验的热情,促进创新性人才的培养,也为微生物实验教学平台的建设起到一定的推动作用。

蛭弧菌； 双层平板法； 相差显微镜； 硝酸银染色； 动态观察

20世纪60年代,Stolp和Petiold在土壤中发现了蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)[1]。它广泛存在于自然界中,其突出的生物学特性为可以寄生并裂解沙门氏菌[2]、弧菌、埃希氏菌[3]等菌属,并且对高浓度的宿主具有趋向性,可以有效地裂解水体中的一些常见病原菌[4],还可以缓解水中一些有害物质的影响[5],因此蛭弧菌被作为一种“绿色”微生态制剂在水产养殖中具有广泛的应用前景[6-9],在畜禽养殖中对致病菌也起到了良好的裂解作用[10]。

为了提高学生学习微生物的兴趣,更好地锻炼实验操作能力,我们首次在教学中开设了对蛭弧菌研究的相关实验。通过双层平板法观察蛭弧菌裂解大肠杆菌后形成的噬菌圈和利用蛭弧菌对污水生物净化效果的观察实验,让学生亲自验证了蛭弧菌特有的生物学特性,即可以有效地清除裂解污水中细菌,起到良好的净化作用[11]。为了让学生能够更直观地观察到蛭弧菌,用硝酸银染法对其染色,在普通光学显微镜下镜检可观察到蛭弧菌显微结构和形态[12]。但受普通光学显微镜成像效果的影响,其观察及拍照效果不很理想,学生自己寻找目标有一定难度,而且不能观察到其动态过程。因此,本文采用相差显微镜对蛭弧菌进行观察,不仅可以更为清晰地观察到制片固定后的形态结构,而且可以直接观察蛭弧菌鞭毛游动以及捕捉大肠杆菌的实时动态画面。该创新性实验的开设,极大地激发了学生对微生物实验的热情,拓宽了学生的实验思路,有利于创新性人才的培养,在高校本科微生物教学中值得推广。

1 实验材料

1.1 仪器及器材

(1) 仪器:奥林巴斯相差显微镜BX43型(CCD DP27数码成像系统)；生化培养箱LRH-250A型；电子天平BS224S型；高压灭菌锅LDZX-30KBS型；电热干燥箱DHG-9240型；超净工作台SW-CJ-1F型；冰箱BCD-301型；高速离心机LR56495型。

(2) 器材:玻璃试管；培养皿；移液枪(5 mL、1 000 μL、50 μL、10 μL)；酒精灯；三角瓶；细菌过滤器。

1.2 菌种

大肠杆菌(E.coil)；蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)(蛭弧菌由四川大学生命科学学院徐恒教授课题组惠赠)。

1.3 培养基

(1) 牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121℃高压灭菌20 min。

(2) 双层平板培养基:上层LB培养基:蛋白胨5 g,酵母提取物1.5 g,NaCl 2.5 g,琼脂4 g,蒸馏水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121℃高压灭菌20 min；下层琼脂培养基:琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121 ℃高压灭菌20 min。

(3) LB培养基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121℃高压灭菌20 min

1.4 试剂

(1) 媒染试剂A液:单宁酸5 g,FeCl31.5 g,蒸馏水100 mL,15 %福尔马林2 mL,1% NaOH 1.0 mL。

(2) 媒染试剂B液:AgNO32 g,用蒸馏水100 mL溶解,再滴入浓NH4OH,使之成为很浓的悬浮液;再继续滴加NH4OH,直到新形成的沉淀重新刚刚溶解为止;再将备用的10 mL的AgNO3慢慢滴入,出现薄雾但轻轻摇动后薄雾状沉淀又消失,再滴入AgNO3直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。

2 实验方法

2.1 双层平板法培养蛭弧菌

2.1.1 宿主菌的制备

将宿主菌大肠杆菌接种至LB斜面培养基上,37 ℃下培养24 h后,吸取1 mL无菌水至斜面试管中,用接种环使菌苔分散乳化备用。

2.1.2 蛭弧菌的培养

将3 mL灭菌的上层半固体LB培养基放置室温冷却至约50 ℃,分别吸取0.2 mL大肠杆菌悬液和0.3 mL蛭弧菌悬液打入其中；混匀后迅速倾倒于已配置好的下层琼脂培养基上；冷却凝固后放于32 ℃培养箱倒置培养,24～120 h后观察到透明圈即为长有蛭弧菌的噬菌斑。

2.1.3 蛭弧菌悬液制备

在1.5 mL EP管中加入1 mL无菌水,用接种环挑取蛭弧菌噬菌斑单斑培养基放于其中，在32 ℃培养箱中放置1 h，12 000g离心2 min,得到蛭弧菌悬液备用。

2.2 蛭弧菌形态观察

勾取上述培养好的蛭弧菌噬菌斑单斑,按上述方法制备蛭弧菌悬液，蛭弧菌在单极端长有一根长而粗的鞭毛,用硝酸银法对其鞭毛进行染色；取100 μL蛭弧菌悬液滴加在载玻片上,均匀涂布后自然干燥；用媒染试剂A液覆盖菌面,染色5 min,用蒸馏水冲洗；用几滴媒染试剂B液冲去残留水分,再滴加覆盖菌面数秒至1 min；当出现明显浅褐色时立即用蒸馏水冲洗,自然干燥后用相差显微镜镜检,并利用CCD DP27数码成像系统拍照。

2.3 蛭弧菌动态观察

滴加1滴蛭弧菌悬液于载玻片上,用镊子取少许棉花(阻止蛭弧菌运动),小心盖上盖玻片,避免气泡产生,用相差显微镜镜检,并利用CCD DP27数码成像系统拍摄视频。

3 结果与分析

3.1 蛭弧菌噬菌斑的观察

结果：与只加有大肠杆菌的阴性对照板相比,加入有蛭弧菌的双层平板上出现明显的透明噬菌斑。

3.2 显微观察蛭弧菌形态

用银染法染色后,可以清晰地看到呈逗点状的蛭弧菌,其后长有一根鞭毛(见图1)。另外,还可以观察到大肠杆菌被蛭弧菌“入侵”后、裂解之前的形态(见图1)。其外露出来的一条“尾巴”即为蛭弧菌的鞭毛,但其菌体已进入到大肠杆菌菌体内。

3.3 蛭弧菌动态观察

利用相差显微镜对液态涂片进行观察,不仅可以看到大肠杆菌在其中快速游动,而且还可以观察到蛭弧菌端鞭毛在不断地摆动(见图2)。当加大悬液中蛭弧菌的浓度后,还观察到了蛭弧菌跟随、捕食大肠杆菌的动态图像(见图3)。

4 结论

(1) 蛭弧菌呈单细胞结构,端生鞭毛,为逗点状、杆状或弧状,而且是能够通过细菌滤器的细菌。通过该创新实验的学习,纠正了学生在以往学习过程中普遍认为的所有细菌都不能通过细菌滤器的观念。我们开发的蛭弧菌污水净化实验使学生了解到了双层培养基的制作过程和应用,认识到蛭弧菌对水体的净化作用。蛭弧菌形态及动态观察实验不仅让学生直观地观察到了细菌个体,而且观察到了细菌的运动方式。通过这些综合性实验的训练,锻炼了学生的动手能力和科研思路,而且与实际问题相结合,使学生学习更有针对性。

图1 单蛭弧菌形态和蛭弧菌侵入大肠杆菌形态(100×10)

图2 蛭弧菌连续运动

(2) 蛭弧菌大小为(0.3～0.6) μm×(0.8～1.2) μm[13],仅为大肠杆菌的1/4～1/3,一般要通过电子显微镜才能观察到,但由于设备昂贵,制片要求较高,本科教学实验室不具备开设观察形态课程的条件。虽然普通显微镜通过银染法可以观察到蛭弧菌的形态,但没有相差显微镜清晰。本实验利用操作相对简单的银染法染色,通过相差显微镜不仅可以观察到蛭弧菌的形态,还可以清楚地看到蛭弧菌侵入大肠杆菌后的菌体形态。在制片过程中需要注意,滴加蛭弧菌和大肠杆菌悬液并均匀涂开后要自然风干,以免破坏蛭弧菌的鞭毛结构。为了便于观察，让背景更为干净,在滴加硝酸银染色时,切不可停留时间过长。

(3) 制作了蛭弧菌和大肠杆菌的液态片,并观察到蛭弧菌和大肠杆菌的运动过程。当加大蛭弧菌浓度后,还观察到了蛭弧菌跟踪、捕食大肠杆菌的动态过程。利用相差显微镜、CCD DP27数码成像系统和CellSens Entry配套软件,学生可以在电脑屏幕上找寻到合适目标并拍照或摄像。该软件简单易懂,适合在教学中使用。

该实验的开设,突破了原有高校本科生基础实验课程内容一成不变的特点,使微生物实验课程变得更为生动有趣,有助于培养学生学习微生物的积极性,促进微生物实验教学平台的建设并更好地服务于学生。

References)

[1] Stolp H,Petzhold H. Undersuchunger ubereigen obligat parasitischen mikroorganismus mit lytischer aktivitat furPseudomona-bacterien[J]. Phytopathol Z,1962,45(4):364-390.

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Study on opening morphological and dynamic observation ofBdellovibrioin microbilolgy experimental teaching

Yu Ying, Lu Meng, Luo Yao, Fu Jiaqi, Lin Wenhe, Zhang Jie, Wang Hong

(Bioscience Experiment Teaching Center,School of Life Science,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Microbiology experimental course plays an important role in microbiology teaching,focusing on training students’ practical abilities and skills. By silver nitrate staining method,theBdellovibriois stained, which was cultured in double plates. TheBdellovibriomorphology and process of invadingE.colicould be clearly observed and recorded using the CCD DP27 digital imaging system of BX43 phase contrast microscope. Furthermore,the motion ofBdellovibrioflagella are also observed using the system.The dynamic processes ofBdellovibriocapturingE.colicould be observed with the same method whenBdellovibriois increased the high concentration. Therefore,students are able to more clear and direct to observe morphology and moment ofBdellovibrio. The experiments can not only stimulate enthusiasm on microbial experiments,but also promote the cultivation of innovative talents, and contribute to the construction of experimental teaching platform for the Microbiology as well.

Bdellovibrio; inverted phase contrast microscope; silver nitrate staining method; dynamic observation

2015- 05- 13 修改日期：2015- 06- 05

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目

于颖(1984—)，女(蒙古族)，内蒙古赤峰，博士，实验师，主要从事微生物实验教学科研工作E-mail：yuyingsea@163.com

汪红(1961—)，女，四川成都，大专，高级实验师，主要从事微生物实验的教学和科研工作.

E-mail：wh002008@163.com

X703.1

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1002-4956(2015)10- 0064- 03