李秀红,林国华,邹卓成

(1.广州市越秀区第二人民医院,广州 510180;2.广州中医药大学第一附属医院,广州 510405)

糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病(DM)常见的一种慢性并发症,主要的常见症状包括早饱、恶心、腹胀、呕吐、打嗝、食欲不振、体重减轻等。目前,国内外现代医学对DGP的病因及发展机理尚未完全阐明,治疗上也无重大突破,而中医药在DGP治疗上逐渐显示其优势。本研究将对糖尿病胃轻瘫的胃肠激素的作用机理进行动物实验的研究,在中医学辨证论治理论指导下,结合现代医学对 DGP的发病机制和辨证分型的认识,探讨有效的针灸疗法的作用机理,明确电针疗法对DGP的疗效,以期更广泛地应用于临床,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级健康 SD雄性大鼠 100只,体重为180～220 g,由广州中医药大学实验动物中心提供。动物饲养及实验均在广州中医药大学实验动物中心 SPF级实验室进行。

1.2 DM模型制作[1]及分组

将100只SD大鼠先稳定饲养3 d,均经尿糖试纸检测为尿糖阴性,剔除阳性动物。随机分为对照组 30只和造模组70只。造模组给予禁食12 h后称重,按大鼠总重量比称取 STZ,放置在干燥灭菌瓶内,外用锡纸包好,将柠檬酸缓冲液及装有未溶解的 STZ的瓶子置冰浴(2～8℃),干燥避光保存。再将STZ用0.1 mmol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH值为4.5)配制成浓度为1%的溶液,按 55 mg/kg的剂量经腹腔一次性注射,确保 STZ在溶解后30 min内注射完毕。注射后1、3、7 d分别测定大鼠非空腹尾静脉血糖值,选用血糖浓度持续＞16.65 mmol/L。尿糖在3+～4+且能维持1星期以上者确定为DM模型建立。DM大鼠继续饲养10星期,所有大鼠均自由进食。造模组使用STZ注射造成大鼠一部分胰岛B细胞功能的破坏,外周组织对胰岛素不敏感,同时喂以高脂(高糖)饲料,两者结合便可诱导出病理、生理均接近人类2型DM的动物模型。在造模成功的大鼠中分别随机选取30只作为模型组和治疗组。

1.3 治疗方法

1.3.1 治疗组

取足三里、中脘、胃俞穴,左右两侧轮换取穴,取穴方法参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》。将大鼠放入自制的大鼠固定器中,75%乙醇常规消毒后,采用0.25～0.40 mm×13 mm毫针进行针刺,针刺深度为0.3～0.4寸,针刺后接上海泰成科技发展有限公司生产的LH202H型韩氏穴位神经刺激仪,刺激波形选用15 Hz等幅波,强度以穴位皮肤轻微抖动为度,留针15 min。治疗后正常进食。每日1次,5次为1个疗程,疗程间休息2 d,共治疗3个疗程。

1.3.2 模型组

在治疗组接受治疗时,模型组大鼠也放入固定器中固定相同的时间。

1.3.3 对照组

不作任何处理。

1.4 观察指标及检测

1.4.1 一般状况

每日观察动物的饮食情况、大小便、活动状况、皮毛光泽度及死亡情况,每星期测体重1次。

1.4.2 血糖检测

所有大鼠实验结束前1 d尾静脉取血测非空腹血糖。

1.4.3 胃肠推进率

末次电针后,各组大鼠禁食24 h,再经口给予10%炭粉混悬液(其中活性炭和阿拉伯胶各占10%)按1 mL/100 g体重用量灌胃,30 min后用乙醚进行麻醉,麻醉后将大鼠颈椎脱臼处死,打开腹腔用镊子轻轻提取上端至幽门、下端至回盲部的肠管,并置于托盘上,再将小肠拉成直线,用直尺测量胃肠推进指标,胃肠推进指标通过以下公式计算得出,胃肠推进率=(炭粉前端至幽门扩约肌距离/幽门括约肌至小肠末端距离)×100%。

1.4.4 血清胃动素(MOT)、生长抑素(SS)的测定

各组大鼠麻醉后从眼睛取血 4 mL,置于无抗凝离心管(测血清MOT和 SS),全血标本置于 4℃过夜后于1000×g离心20 min,取上清置于-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。并送本校核医学室用 ELISA法测定,所有标本均在同一批中完成测定。试剂在使用前平衡至室温。

1.4.5 胃窦组织MOT、SS的测定

剖腹取胃窦部新鲜组织各 1块,置于﹣20℃冰箱保存备用匀浆。将制备好的 10%匀浆用离心机3000 r/min左右离心10～15 min,取上清液置于-20℃或-80℃保存备用送检。

1.5 统计学方法

所有数据均以均数±标准差表示,应用 SPSS13.0统计软件进行处理,多组资料间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验期间,对照组大鼠表现为机警、活泼、反应快、毛发光滑、皮毛致密、有光泽,生长、进食及二便均正常,实验期间无死亡。造模组大鼠造模后第3天开始出现进食饮水量增加,尿量增多,随后出现持续性多饮、多食(进食饮水量为对照组的2～3倍),尿量增多,体重减轻;至第4星期时部分大鼠出现食量减少,大便性状改变,稀便与干结便均可见到;第6星期时绝大部分大鼠除仍有多饮、多尿外,还可见到食量明显减少、消瘦、精神倦怠、反应迟钝、皮毛疏松无光泽、腹部膨隆、大便干稀不等。造模组实验期间大鼠未治疗前死亡9只(12.9%),具体死亡原因不明,估计跟最初造模成功后,血糖升高过快出现高血糖有关;或饮水量不足,因为饥渴相互间互相厮杀等。治疗期间未见死亡及丢失情况。

治疗组治疗1个疗程(5 d)后,大部分大鼠症状逐步好转,开始出现食量增加,大便性状得到不同程度的改善,皮毛逐渐恢复光泽,体重增加。

2.2 各组大鼠治疗后一般情况比较

由表 1可见,治疗组和模型组大鼠体重及胃肠推进率与对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01),提示DGP模型诱导成功。治疗组治疗后体重及胃肠推进率与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01),提示治疗组能明显改善DGP大鼠体重及胃肠推进率。

表1 各组大鼠治疗后一般情况比较 (±s)

表1 各组大鼠治疗后一般情况比较 (±s)

注:与对照组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01

组别 n 体重(g) 胃肠推进率(%)治疗组 30 361.07±31.401)2) 58.50±4.331)2)模型组 30 282.77±33.561) 45.43±6.111)对照组 30 518.67±38.97 69.60±3.73

2.3 各组大鼠血糖值变化比较

由表2可见,治疗组和模型组大鼠造模后、治疗10星期后及治疗后血糖值与对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。治疗组治疗后血糖值与模型组比较,差异统计学无意义(P＞0.05)。治疗组治疗后血糖值与同组治疗10星期后比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。

表2 各组大鼠血糖变化比较 (±s,mmol/L)

表2 各组大鼠血糖变化比较 (±s,mmol/L)

注:与对照组比较1)P＜0.01;与同组治疗10星期后比较2)P＜0.01

组别 n 造模后 治疗10星期后 治疗后治疗组 30 28.17±1.161) 26.21±0.991) 22.56±1.041)2)模型组 30 28.21±0.961) 26.24±0.941) 26.17±1.101)对照组 30 5.74±0.63 5.52±0.62 5.65±0.57

2.4 各组大鼠血清及胃窦组织中MOT和SS含量比较

由表 3可见,治疗组和模型组血清及胃窦组织中MOT和SS含量与对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。治疗组治疗后血清及胃窦组织中 MOT和SS含量与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。

表3 各组大鼠血清及胃窦组织中MOT和SS含量比较(±s,pg/mg)

表3 各组大鼠血清及胃窦组织中MOT和SS含量比较(±s,pg/mg)

注:与对照组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01

组别 n 部位 MOT SS治疗组 30 血清 164.86±20.711)2) 107.59±8.271)2)胃窦组织 122.67±7.181)2) 58.90±11.491)2)模型组 30 血清 256.68±21.451) 73.59±6.481)胃窦组织 46.70±6.771) 66.99±10.291)对照组 30 血清 51.59±13.55 57.13±6.55胃窦组织 22.18±6.30 29.36±8.23

3 讨论

3.1 关于STZ制作糖尿病大鼠模型的研制

大鼠腹腔内或尾静脉注射STZ导致糖尿病是通过STZ选择性作用于大鼠胰腺,造成大鼠胰岛B细胞不可逆损伤而不能产生胰岛素,从而使血糖升高,是一种胰岛素依赖型DM动物模型[2]。本研究中,我们给造模组大鼠按55 mg/kg的剂量一次性腹腔注射配制好的STZ液。造模24 h后血糖≥16.65 mol/L,稳定5 d即作为造模成功。结果显示造模成功的大鼠实验期间血糖持续≥16.65 mol/L,尿糖阳性(++～++++),并伴有典型的“三多一少”、体重增长较慢,而对照组大鼠无“三多一少”表现,体重上升较快。以上研究表明,本实验所复制的DM模型是成功的,STZ法可以通避选择性破坏胰岛细胞成功造成DM模型。胃肠功能障碍是DM常见并发症。

3.2 本研究中DGP大鼠模型的确立

从实验过程中观察发现,在动物模型的喂养过程中大约从DM形成的4星期左右开始,部分DM大鼠的进食量开始下降,大便量与大便性状出现异常,6星期后绝大部分DM大鼠除有多饮、多尿外,还可见到食量明显减少、消瘦、精神倦怠、反应迟钝、皮毛疏松无光泽、腹部膨隆,大便干稀不等,并随时间的延长由轻到重,其异常逐渐显著。本实验在DM模型建立约10星期后,采用炭粉推进率反映大鼠胃肠运动功能的指标,结果表明模型组的胃肠排空指数较低,与对照组相比较有显著性差异(P＜0.01)。说明DM确实存在胃肠运动功能减弱现象,提示DM大鼠胃排空延迟,存在糖尿病性胃轻瘫。本实验所建立的大鼠DGP模型是成功的。

3.3 电针治疗选穴原则

本实验根据俞募合配穴法选用后三里、中脘、胃俞三个穴位进行电针治疗。《难经本义》:“阴阳经络,气相交贯,脏腑腹背,气相通应。”说明脏腑之气与俞募穴是相互贯通的。《素问·阴阳应象大论》:“故善用针者,从阴引阳,从阳引阴;阳病治阴,阴病治阳。”选用胃的俞募穴胃俞及中脘相配,一阳一阴,使阳气上升、浊阴下降,从而恢复中焦的升降功能。中脘、胃俞分别位于上腹部和背部,虽分别属于任脉和膀胱经,但二穴分别是胃之募穴和背俞穴,是本腑之气输注或汇聚之处,故也可治疗胃腑病。足三里为胃之下合穴,《灵枢·邪气藏府病形》:“合治内腑。”《素问·咳论》:“治府者治其合。”下合穴是治疗六腑病症的主要穴位,而本病病位主要在胃,胃属腑,取足三里有和胃通腑、降浊止呕之功;《四总穴歌》:“肚腹三里留。”取足三里以降气除胀之功,与中脘和胃俞相配。故诸穴合用具有健脾和胃、健运中州、通腑降浊的功效,能调节肠胃运动,明显减轻DGP各症状。吴湘等[3]发现针刺足三里后,糖尿病胃轻瘫患者胃收缩频率、胃窦收缩幅度及胃排空率明显增加。同时,胃肠的运动是由电生理控制的[4],电针也在一定程度上影响着其电生理活动。

3.4 各指标检测结果的讨论

本实验采用炭粉推进率反映大鼠胃肠运动功能的指标,为目前常用反映胃肠运动功能的检测指标[5],主要用于了解固体食物排空情况。本研究中结果显示,模型组胃肠推进率与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01),说明用STZ造模的DM大鼠确实存在胃肠运动功能减弱现象,提示本实验DGP模型诱导成功。治疗组胃肠推进率较对照组显著降低(P＜0.01),较模型组显著增加(P＜0.01),提示电针有较强的促胃肠运动作用。

治疗组治疗后血糖值与模型组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但与同组治疗10星期后比较,差异具有统计学意义(P＜0.01),提示电针不仅有较强的促胃肠动力作用,还可能通过加速胃排空而调节DGP大鼠的血糖。其机理可能是电针促使胃肠蠕动加快,食物均匀地排入小肠,餐后对营养物质吸收较模型组及电针治疗前提前。研究表明穴位刺激能在一定程度上降低糖尿病者血糖水平,而加速胃肠排空也能在一定程度上改善血糖水平。因此,尚不能确定本研究治疗组治疗后血糖浓度值较造模组及同组治疗前实验观察低是由穴位刺激直接降糖引起还是由加速胃排空引起的,或是两者同时起作用的结果。

MOT属于兴奋胃肠运动的脑肠肽,是启动消化间期胃肠移行性复合运动的重要激素[6],静脉注射MOT对正常人消化期的胃肠运动无明显影响,但却能明显加速DGP患者餐后胃对液体和固体食物的排空。有研究[7-11]报道,SS可以抑制生长激素、甲状腺刺激激素、胰岛素、胰高血糖素的分泌,可抑制胃蛋白酶、胃泌素的释放,并且减少胰腺的内外分泌以及胃小肠和胆囊的分泌,降低酶活性,对胰腺细胞有保护作用,可影响胃肠道吸收和营养功能。可见相关的文献报道[12]。本实验观察糖尿病大鼠血清MOT和SS的含量,研究结果显示模型组大鼠血中MOT水平显著升高,与对照组有显著性差异,模型组血清SS升高不明显,而电针能明显降低DM大鼠血中胃动素水平以及提高SS水平。Kawagishi T等[13]发现伴神经病变的DGP患者体内MOT水平较对照组高,正常对照组胃排空同血浆MOT水平呈正相关,即MOT水平高,胃排空也较快,但DGP患者却成负相关,即MOT水平比正常人高,而胃排空反而比正常人慢。另外,李丽霞等[14]在观察电针对DGP大鼠MTL及胃泌素的影响时发现DGP大鼠血浆中MOT显著升高,电针治疗后血浆MOT水平下降,说明电针能改善DGP大鼠血中高MOT状态,这与本研究结果相一致。DM患者血中胃动素水平增高可能与其作用效能下降有关,是一种代偿性表现。SS可以抑制胃肠激素的分泌,电针降低糖尿病血中MOT可能与SS水平提高及加速胃排空功能有关。本实验中模型组血清及胃窦组织中SS均较对照组显著升高,这与其他文献研究[15]一致。在胃窦组织中,模型组MOT水平升高不明显而SS升高,原因可能是当DM大鼠血中MOT升高时,外周组织的MOT水平则相对降低,并且可能与胃窦分泌的SS相对增高有关。而治疗组中胃窦组织MOT水平升高及SS水平下降,这一结果与林国华等[16]的研究一致,说明电针能显著改善这一状况,胃窦组织MOT升高,胃排空则加强,故实验研究提示,电针可改善DGP大鼠的胃肠动力障碍。此外,本实验结果显示电针能够升高DM大鼠血清SS水平和降低胃窦组织中的SS水平,但二者之间的相互变化关系尚不明确,亦未见相关的文献报道,故有待进一步的研究。

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