周 婷,金 昭,高 飞,蔡国林,陆 健,4，*

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;4.宿迁市江南大学产业技术研究院,江苏宿迁 223800)

阿拉伯木聚糖的氧化交联与啤酒大麦麦芽过滤性能的相关性研究

周 婷1,2,3,金 昭1,2,3,高 飞1,2,3,蔡国林2,3,陆 健1,2,3,4，*

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;4.宿迁市江南大学产业技术研究院,江苏宿迁 223800)

本文以18个大麦麦芽样品为研究对象,以pearson相关分析法研究了大麦麦芽中过氧化物酶(Peroxidase,POD)、麦汁中键合态阿魏酸以及多聚阿拉伯木聚糖(PAX)与麦芽过滤性能的相关性。研究结果表明:麦芽过滤速度与麦芽POD酶活、麦汁粘度、麦汁中键合态阿魏酸及PAX含量呈显著负相关,相关系数分别为0.632(p<0.01)、0.521(p<0.05)、0.555(p<0.05)和0.664(p<0.01);PAX含量与键合态阿魏酸含量、麦汁粘度呈显著正相关,相关系数分别为0.590(p<0.05)和0.595(p<0.01)。这一结果表明,阿魏酸介导的AX的氧化交联与大麦麦芽过滤性能紧密相关,很可能是AX导致麦芽过滤性能差的重要途径之一。本文为改善大麦麦芽过滤性能提供了一定的理论依据。

大麦麦芽,过滤性能,阿拉伯木聚糖,氧化交联,过氧化物酶,阿魏酸

图1 AX-FA基本结构示意图Fig.1 Basic structure of AX-FA

图2 AX氧化交联示意图Fig.2 Prosess of oxidative cross-linking of AX

阿拉伯木聚糖(arabinoxylan,AX)是谷物种子中主要的非淀粉多糖,其基本结构是以(1→4)-β-D-吡喃木糖残基单元聚合为线型主链,通过C(O)-2、C(O)-3或C(O)-2,3糖苷键连接α-L-阿拉伯呋喃糖基取代物[1],通常根据溶解性分为两大类:水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractable arabinoxylans,WEAX)和水不溶性阿拉伯木聚糖(water-unextractable arabinoxylans,WUAX)。大麦麦芽中WEAX的含量一般为0.49%～0.69%[2]。

AX在啤酒酿造过程中会引起一系列问题,比如,降低麦芽浸出率、增加麦汁粘度、降低过滤速度等[3]。AX具有特殊的氧化交联性质,在其木聚糖侧链上的阿拉伯糖残基C(O)-5位上连接有阿魏酸基团(Ferulic Acid,FA),形成AX-FA聚合物,如图1所示[4]。当WEAX与过氧化物酶(Peroxidase,POD)/H2O2体系共存时,WEAX结构中的FA发生聚合,WEAX分子则通过FA分子间的聚合而交联在一起,发生氧化交联反应[5],如图2所示,形成大分子网络结构而麦芽中大分子物质之间相互作用形成的复杂大分子物质是影响麦芽过滤性能的直接原因[6-7],因而,WEAX的交联反应很可能对麦芽过滤性能具有负面作用。Stephenson等研究表明,糖化过程中存在通过FA介导的WEAX的氧化交联反应,并推测该氧化反应是麦汁过滤的不利因素[8]。孔维宝等研究认为,POD所促进的AX的交联产物对啤酒的澄清度和过滤特性可能有潜在的影响[9]。但目前,关于FA介导的AX的氧化交联对麦芽过滤性能的影响只是推测,具体的研究还没有报道。

本文基于统计学原理,检测18个国内外啤酒大麦麦芽样品中POD酶活、麦汁中AX-FA与PAX含量,并与麦芽的过滤性能之间进行相关性分析,为进一步揭示AX对麦芽过滤性能造成负面影响的原因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验商品麦芽见表1。阿魏酸标准品 购自Sigma公司;辣根过氧化物酶 为生化试剂,购自国药集团化学试剂有限公司;甲醇 色谱纯;乙酸乙酯、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、间苯三酚等 均为国产分析纯。

Agilent 1260高效液相色谱仪 安捷伦公司;Haake落球式粘度计 Thermo公司;UV-2100型紫外可见分光光度计 尤尼柯仪器有限公司;自动糖化器 轻工部西安轻机所光电公司;麦芽标准粉碎机 北京德之杰啤酒技术有限责任公司;WGZ-2-PJ浊度计 上海昕瑞仪器仪表有限公司;H1850R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

表1 18个大麦麦芽样品基本信息Table 1 Information of 18 barley malts

注:(1)、(2)、(3)、(4)代表来自于不同产地或年份的同一品种的大麦麦芽。

1.2 实验方法

1.2.1 协定糖化麦汁指标的测定 协定糖化麦汁指标测定方法参考自欧洲啤酒协会标准[10]。协定糖化麦汁测定的指标主要包括:麦汁过滤速度(T30 min,即协定麦汁在100mL回流后,30min内麦汁滤液的体积)、浊度、粘度,AX和PAX含量等。

1.2.2 麦汁中键合态阿魏酸含量的测定 麦汁中游离阿魏酸的提取:30mL麦汁用2mol/L HCl调节pH至2.0,添加0.5g KCl,样品用10mL乙酸乙酯提取三次,有机组分蒸发干燥(40℃,0.9bar真空),溶于10mL甲醇中,样品经微孔过滤(0.45μm),用于HPLC-UV检测[11]。

麦汁总阿魏酸的提取:30mL麦汁与含有EDTA(10mmol/L)和1%(w/v)抗坏血酸的15mL NaOH(2mol/L)混合,萃取30min,用2mol/L HCl调节pH至2.0,添加0.5g KCl,样品用10mL乙酸乙酯提取三次,有机组分蒸发干燥(40℃,0.9bar真空),溶于10mL甲醇中,样品经微孔过滤(0.45μm),用于HPLC-UV检测[11]。

麦汁中键合态阿魏酸(AX-FA)含量(μg/mL)=总阿魏酸含量(μg/mL)-游离阿魏酸含量(μg/mL)。

1.2.3 HPLC法分析检测阿魏酸 色谱条件:Zorbax EcIipse XDB-C18(250mm× 4.6mm i.d.,5μm)色谱柱(安捷伦公司);流动相为 含0.1%乙酸的水溶液(A相)和0.1%乙酸的甲醇溶液(B相);梯度洗脱条件如下:0min,5% B;15min,20% B;45min,60% B;50min,80% B;52min,5% B;60min,5% B。紫外检测波长为320nm,柱温25℃,流速 lmL/min,进样量20μL[12]。

1.2.4 大麦麦芽过氧化物酶(POD)的提取 称取细粉大麦麦芽样品5g,置于100mL预冷烧杯中,加50mL 0.05mol/L pH6.0的磷酸缓冲液,0.5g PVPP,4℃,磁力搅拌器搅拌提取1h;提取液以10000×g 4℃离心20min,取上清液定容至50mL,保存于4℃冰箱中待测POD[13]。

1.2.5 过氧化物酶(POD)的酶活测定 取50mL pH6.0磷酸缓冲液和28μL愈创木酚于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚完全溶解,待溶液冷却后,加入30%的H2O219μL,混合均匀后4℃保存。取该混合液3mL,加入20μL粗酶液,以加20μL磷酸缓冲液的反应混合液为对照,470nm波长下测其吸光度,每隔1min记录一次吸光度值,一共记录5次[14]。

酶活定义:每分钟内A470变化0.01为一个酶活单位(U),酶活表示为U/g干物质。

1.2.6 糖化阶段添加H2O2实验 在Metcalfe麦芽糖化起始阶段添加不同浓度的H2O2,糖化结束后,测定麦芽的过滤性能及相关指标。

1.2.7 POD酶活、AX-FA及PAX含量与过滤速度的关系分析 将18种麦芽按过滤速度分为三类:慢速(<150mL/30min)、中速(150～240mL/30min)和快速(>240mL/30min)。以过滤速度作为因变量,POD酶活、AX-FA及PAX含量三个影响因素为自变量做散点图,分析三者对过滤速度的影响程度。

1.2.8 统计分析 所有实验数据测定3次,取其平均值。运用SPSS18.0软件进行Pearson 相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 18种大麦麦芽POD酶活、麦汁AX-FA及PAX含量和麦芽过滤性能的检测与统计分析

为了研究大麦麦芽中POD酶活、麦汁中AX-FA及PAX含量与麦芽过滤性能(过滤速度、粘度和浊度)之间的关系,收集18个大麦麦芽样品进行检测,结果见表2。由表2可知,18个大麦麦芽样品囊括了10种大麦品种,对以上数据进行分析统计见表3,可以看出,18个大麦麦芽样品过滤速度的变化范围为60～320mL/30min,浊度为0.92～14.44EBC,粘度为1.44～1.65mPa·s;POD酶活为5.9×103～36.6×103U/g干麦芽,平均值为21.1×103U/g干麦芽;麦汁中AX-FA含量为6.39～10.95μg/mL,平均值为9.12μg/mL;麦汁中PAX含量为654.7～997.2mg/L,平均值为818.2mg/L。

表2 18个大麦麦芽样品POD酶活、麦汁AX-FA及PAX含量与麦芽过滤性能Table 2 POD activity,content of AX-FA and PAX in wort,malt filtering performance of 18 barley malts

注:(1)、(2)、(3)、(4)代表来自于不同产地的同一品种的大麦麦芽。

表3 18个大麦麦芽样品POD酶活、麦汁AX-FA及PAX含量与麦芽过滤性能统计分析表Table 3 Statistical analysis of POD activity,content of AX-FA and PAX in wort,malt filtering performance of 18 barley malts

表4 18个大麦麦芽样品POD酶活、麦汁AX-FA及PAX含量与麦芽过滤性能的相关性分析表Table 4 Person correlation analysis among POD activity,content of AX-FA and PAX in wort and malt filtering performance of 18 barley malts

注:*表示在p<0.05显著,**表示在p<0.01显著。

2.2 大麦麦芽中POD酶活、麦汁中AX-FA及PAX含量与麦芽过滤性能之间相关性分析

为了确定FA介导的AX的氧化交联反应是否是大麦麦芽过滤性能的不利因素,采用SPSS 18.0软件对参与AX氧化交联反应的POD、AX-FA及主要产物PAX与麦汁过滤速度、粘度、浊度之间进行相关性分析,分析结果如表4所示。从表4 可以看出,麦汁过滤速度与POD、PAX、AX-FA、粘度均呈一定的负相关性,说明通过FA介导的AX的氧化交联反应与过滤速度之间有着明显的内在联系,减弱糖化过程AX的交联反应,可以提高麦汁的过滤速度。其中麦汁过滤速度与POD及PAX在0.01范围内高度负显著,相关系数为分别为0.632和0.664,而金昭[15]通过比较江苏单二大麦麦芽与加拿大Metcalfe大麦麦芽的代谢蛋白质组,发现在制麦过程中,POD在单二中的表达量高于Metcalfe,推测POD可能是麦芽过滤性能的不利因素。而过滤速度与粘度及AX-FA在0.05范围内显著负相关,相关系数分别为0.521和0.555。孔维宝[13]通过在糖化过程中外加H2O2发现麦汁过滤速度显著降低、浊度升高,分析认为导致这种现象的原因可能是外加的H2O2为POD的酶促氧化酚类物质提供了充分条件,导致多酚的氧化并使其氧化产物与戊聚糖发生交联反应生成高分子聚合物。

表5 不同浓度H2O2对麦汁过滤性能及其指标的影响Table 5 Effect of H2O2 content on filterability and other specifications of wort

为了证明H2O2促进了FA介导的AX的氧化交联反应,本实验在糖化过程中添加H2O2,并检测麦汁中总FA含量,结果如表5所示,发现随着H2O2添加量的增加,FA含量与麦芽过滤速度均大幅度降低,据马福敏等报道,WEAX中添加POD及H2O2会促进氧化交联的发生,FA含量降低,AX分子量增大[1],Dervilly等添加POD/H2O2后检测到了三种阿魏酸二聚体[16],而Faulds等在啤酒糟中也发现了阿魏酸二聚体[17],因此本研究结果表明,外加的H2O2促进了FA的氧化,使其形成阿魏酸二聚体甚至三聚体与多聚体,从而加大了AX的交联反应,产生高分子聚合物,而PAX含量的降低,表明交联形成的大分子PAX,由于分子量过大而滞留在麦糟中,堵塞麦糟,因而使得过滤速度显著降低。以上研究结果可证明,FA是麦芽过滤速度的不利因素。通过抑制FA的氧化,进而牵制AX的氧化交联反应,可以提高麦芽的过滤速度。

李胤等研究表明,麦汁中WEAX与麦汁粘度相关系数为0.790(p<0.01),并认为PAX可能成为一个优于AX的指示阿拉伯木聚糖影响麦汁(啤酒)粘度和过滤的指标[3],此外,Debyser等人认为小麦芽中AX的分子量高于大麦芽中的分子量是导致麦汁粘度升高,过滤速度减慢的原因之一[18]。而本文研究结果表明麦汁粘度与PAX之间呈高度正相关,相关系数为0.595(p<0.01),说明PAX是影响麦汁粘度的重要因素之一。

2.3 麦汁中PAX和AX-FA含量的内在联系

图3 PAX与AX-FA之间的相关性Fig.3 Correlation analysis of PAX and AX-FA

由表4可知,麦汁中AX-FA含量与PAX含量呈显著正相关(r=0.590,p<0.05),说明其用于AX氧化交联的有效性和一致性。PAX含量与AX-FA含量之间的相关性拟合曲线如图3所示,相关方程为y=37.777x+477.7111(R2=0.666)。表明,麦汁中PAX含量受AX-FA含量的影响,AX-FA含量越高,AX氧化交联反应越强烈,进而PAX含量越高,对麦汁过滤速度的负面作用越大。

2.4 不同过滤性能麦芽中POD酶活、AX-FA及PAX含量与麦芽过滤速度的关系

图4 麦芽中POD酶活(A)、麦汁AX-FA含量(B) 及麦汁PAX含量(C)对麦芽过滤速度的影响Fig.4 Effect of POD activity(A),content of AX-FA(B) and PAX(C)on filtration rate of wort

由相关性分析结果可以看出,FA介导的AX的氧化交联反应对麦汁的过滤速度影响较大,对麦汁粘度和浊度的影响相对较小。因此,为了更好的了解麦芽中POD酶活、麦汁AX-FA及PAX含量与麦芽过滤速度之间的关系,进一步将麦芽根据过滤速度分为慢速(<150mL/30min)、中速(150～240mL/30min)和快速(>240mL/30min)进行分析。从图4可以清晰看出麦芽中POD酶活、麦汁AX-FA以及PAX含量对麦芽过滤速度的影响程度。在慢速麦芽中,POD酶活、AX-FA和PAX含量都较高,其平均值分别为26.4×103U/g、10.05μg/g干麦芽和895.4mg/L。随着麦芽过滤速度的增加,中速麦芽中POD酶活、AX-FA和PAX含量都明显低于慢速麦芽,其平均值分别为23.0×103U/g、9.04μg/g干麦芽、809.7mg/L;快速麦芽中POD酶活、AX-FA和PAX含量要远低于慢速麦芽,其平均值分别为14.0×103U/g、8.27μg/g干麦芽和758.7mg/L;而与中速麦芽相比,差距也很明显。因而,通过降低麦芽POD酶活,减少麦汁中AX-FA含量,进而使得麦汁中PAX含量降低,能够提高麦芽过滤速度,改善麦芽过滤性能。

3 结论

本文基于统计学分析法对18个麦芽样品中POD酶活、麦汁中AX-FA及PAX含量与麦芽过滤性能之间进行相关性分析,分析显示麦芽过滤速度与参与AX氧化交联反应的物质(POD、AX-FA)以及主要产物(PAX)均呈显著的负相关性,其中与POD、PAX在0.01范围内高度负显著,相关系数分别为0.632和0.664。此结果表明,AX的氧化交联与麦芽过滤速度关系紧密,因而,AX在POD的促进作用下,通过FA的聚合发生氧化交联,进而产生大分子物质的反应很可能对麦芽过滤速度具有负面影响,是AX影响麦芽过滤性能的重要原因之一。

[1]马福敏,刘燕,王璋,等. 全麦粉中阿拉伯木聚糖氧化交联性质的研究[J]. 食品与发酵工业,2008,34(9):20-26.

[2]鞠云东,张开利,王妮娅,等. 糖化温度对7°P麦汁阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖的影响研究[J].酿酒,2008,35(4):44-47.

[3]李胤. 阿拉伯木聚糖溶解、降解机制的研究及酸性木聚糖酶基因的克隆、表达[D]. 无锡:江南大学,2007,7.

[4]李娟,王莉,李晓瑄,等. 阿拉伯木聚糖对小麦面筋蛋白的作用机理研究[J]. 粮食与饲料工业,2012(1):39-41.

[5]John H,Grabber,Ronald D,et al. Feulate cross-linking in cell walls isolated from maize cell suspensions[J]. Phytochemistry,1995,40(4):1077-1082.

[6]Schneider J,Krottenthaler M,Back W,et al. Study on the membrane filtration of mash with particular respect to the quality

of wort and beer[J]. Journal of the Institute of Brewing,2005,111(4):380-387.

[7]陈继超,郭勇. 国产苏北麦芽麦汁浊度的影响因素研究[J]. 中国酿造,2010(10):87-88.

[8]W.H.Stephenson,J.-P.Biawa,R.E.Miracle,et al. Laboratory-Scale studies of the impact of oxygen on mashing[J]. The Institute&Guild of Brewing,2003,109(3):179-296.

[9]孔维宝,陆健,赵海锋,等. 大麦、麦芽和啤酒酿造中的内源性氧化还原酶[J]. 啤酒科技,2007(1):8-12.

[10]Analytica-EBC,malt. European brewery convention[M]. Fachverlag Hans Carl:Nürnberg,2006.

[11]Dominik Szwajgier. Content of individual phenolic acids in worts and beers and their possible contribution to the antiradical activity of beer[J]. Journal of the Institute of Brewing,2009,115(3):243-252.

[12]刘群涛,李崎,武千钧,等. 反相高效液相色谱法测定啤酒中的酚酸[J]. 分析实验室,2006,25(12):68-72.

[13]孔维宝. 啤酒酿造中酚类物质及其氧化酶类的研究[D]. 无锡:江南大学,2007,6.

[14]崔益军,饶胜其,葛庆丰,等. 浸麦过程中添加金属离子对麦芽内源抗氧化活力的影响[J]. 食品科学,2013,34(3):97-101.

[15]Jin Z,Xiao-Min L,Fei G,et al. Proteomic analysis of differences in barley(Hordeum vulgare)malts with distinct filterability by DIGE[J]. Journal of Proteomics,2013,93:93-106.

[16]G.Dervilly-Pinel,L.Rimsten,L.Saulnier,et al. Water-extractable arabinoxylan from pearled flours of wheat,barley,rye and triticale. Evidence for the presence of ferulic acid dimers and their involvement in gel formation[J]. Journal of Cereal Science,2001,34(2):207-217.

[17]C.B.Faulds. Arabinoxylan and mono-and dimeric ferulic acid release from brewer’s grain and wheat bran by feruloyl esterases and glycosyl hydrolases from Humicola insolens[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2004,64(5):644-650.

[18]Debyser W,delvaux F,Delcour J A. Activity of arabinoxylan hydrolyzing enzymes during mashing with barley malt or barley malt and unmalted wheat[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(12):4836-4841.

Correlation analysis of arabinoxylan oxidative cross-linking and barley malt filtration performance

ZHOU Ting1,2,3,JIN Zhao1,2,3,GAO Fei1,2,3,CAI Guo-lin2,3,LU Jian1,2,3,4，*

(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3. School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian,888 Renmin Road,Suqian 223800,China)

In this study,peroxidase(POD)activity,bound ferulic acid and polyarabinoxylan(PAX)contents,and filterability of 18 barley malts were analysed. And the correlations between them were studied by pearson correlation analysis. The results showed that there were significantly negative correlation between the filtration rate and the POD activities,wort viscosity,bound ferulic acid and PAX content in wort,the correlation coefficient were 0.632(p<0.01),0.521(p<0.05),0.555(p<0.05)and 0.664(p<0.01)respectively. While as there were positive correlation between the content of PAX and the content of bound ferulic acid,wort viscosity,the correlation coefficient were 0.590(p<0.05)and 0.595(p<0.01)respectively. The result showed that the oxidative cross-linking of AX through ferulic acid polymerization could be associated with barley malt filtration performance. Further more,it was likely to result in poor malt filtration. This study provided a new theory for improving the filterability of barley malt.

barley malt;filterability;arabinoxylan;oxidative cross-linking;peroxidase;ferulic acid

2014-07-24

周婷(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：酿酒科学与工程。

*通讯作者:陆健(1968-)，男，博士，教授，主要从事酿造酒微生物与酶技术研究。

国家自然科学基金项目(31171736)；国家863计划(2013AA102109)；江苏省普通高等学校科研成果产业化推进项目(JHB2012-26)；江苏省科技支撑计划(BE2012397)；江苏省高校优势学科建设工程资助项目；高等学校学科创新引智计划(111计划)资助项目(111-2-06)；安全食品精深加工科技创新平台建设(2012B091400030)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)11-0110-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.014