龚 频， 白晓换， 陈福欣， 马 伟

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054)



镉损伤小鼠肾脏形态学研究及姜黄素的保护作用

龚 频1， 白晓换1， 陈福欣2， 马 伟1

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054)

采用腹腔注射CdCl2(2 mg/kg/day)和灌胃不同浓度的姜黄素，连续处理7天构建染镉小鼠模型，通过丙二醛(MDA)含量测试小鼠体内脂质过氧化水平验证模型是否构建成功，利用光镜技术观察镉致肾脏组织形态学的改变，通过元素分析以及金属螯合实验探讨姜黄素保护镉致肾脏损伤的保护机制.结果显示,镉的毒性能够引起肾脏损伤组空泡增多并出现细胞炎症侵润，细胞核发生聚集现象，而姜黄素保护可以减少空泡的形成；同时元素分析表明镉可以在肾脏中蓄积，影响必需元素的吸收，而姜黄素可以呈剂量依赖螯合Cd2+，进而抑制镉对肾脏的损伤.

镉； 姜黄素； 螯合能力； 肾脏形态学改变

0 引言

重金属镉是一类具有肾脏毒性的环境污染物，具有生物半衰期长、代谢率低等特点，对肾脏、肝脏、心脏及睾丸都可产生毒害作用[1]，故被美国毒物与疾病登记局列为第六位危及人体健康的有毒物质.人群研究以及动物实验表明肾脏是镉中毒的重要靶器官[2]，毒性会造成肾小球滤过率降低，致机体出现蛋白尿.近年来很多研究表明，镉引发肾脏损伤可以间接导致高血压的发生[3].

姜黄素是从中草药中提取的一类有效的天然活性物质，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗脂质过氧化等作用[4-6]，是典型的一药多用型药物[7]。姜黄素的抗氧化机制[8]主要是通过增加谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化歧化酶活性，降低肾脏的氧化损伤.在细胞膜发生脂质过氧化反应时，由于含有酚羟基，本身可脱H氧化，提供电子给自由基，从而有效地终止自由基的连锁反应[6].已有研究[9]发现姜黄素预处理(50 mg/kg) 能有效保护由镉介导(7 mg/kg 氯化镉)的肝脏中的脂质过氧化水平以及对 GPx活性的抑制.Daniel[10]发现姜黄素抑制由镉介导的记忆力减退、脂质过氧化水平升高等毒性作用，可能与姜黄素与镉相互作用形成螯合物有关，为姜黄素对金属毒性的防护提供了有利线索.

本研究利用光镜技术观察镉对小鼠肾脏的损伤作用及姜黄素对肾脏损伤的保护作用，并探讨了姜黄素的保护作用机制.

1 材料与方法

1.1 实验材料

氯化镉(CdCl2)购自天津市福晨化学试剂厂;生理盐水购自西安京西双鹤药业有限公司;姜黄素、甲基纤维素钠购自广州市红星试剂厂;苏木精、曙红、邻菲罗啉、其他试剂为分析纯.

1.2 动物分组和模型构建

雄性昆明小鼠30只，购买自第四军医大学实验动物中心，体重(20±2) g，实验前适应性饲养3天，自由取食饮水.随机将小鼠分成5组，每组7只.模型构建:K.空白组: 腹腔注射生理盐水和喂饲生理盐水；S.镉损伤组组: 腹腔注射CdCl2水溶液(2 mg/kg/day)和喂饲生理盐水；A.低剂量保护组: 分别腹腔注射CdCl2(2 mg/kg/day) 和喂饲姜黄素混悬液(25 mg/kg/day)；B.中剂量保护组:分别腹腔注射CdCl2(2 mg/kg/d) 和喂饲姜黄素混悬液(50 mg/kg/day)；C.高剂量保护组:分别腹腔注射CdCl2(2 mg/kg/day) 和喂饲姜黄素混悬液(100 mg/kg/day).

每天给药1次，持续给药7天.根据肾脏脂质过氧化反应程度判断模型是否构建成功.

1.3 组织形态学切片制作

最后1次注药24 h后，断颈处死小鼠，取新鲜肾脏组织保存在10%的福尔马林中，梯度(30%，50%，70%，90%，100%乙醇)脱水，乙醇∶二甲苯(1∶1)、二甲苯、石蜡进行透蜡，最后包埋于石蜡，制作厚度为5 mm的切片，制好的石蜡切片于二甲苯中脱蜡，由高浓度到低浓度的乙醇逐级复水，苏木精曙红染色，400×光镜下观察肾脏形态.

1.4 元素含量检测

准确称取肾脏的重量，在马弗炉中灰化，灰烬溶于8 mL的3 mol/LHNO3中，使用偏振塞曼原子吸收光度计，采用火焰法测定样品中的Zn2+、Cd2+元素的含量(μg/g tissue).

1.5 姜黄素金属螯合能力实验

本实验按照Gong等[11]的方法进行.不同体积、浓度为1 mg/mL的姜黄素加入到1 mmol/L的CdCl2(溶于NaAc-HAc缓冲液，pH 5.0)溶液中，通过加入4 mmol/L的邻菲罗啉(溶于NaAc-HAc缓冲液，pH 5.0)来起始反应，反复振荡混合物，室温下静置10 min.当反应达到平衡后，于568 nm下测量吸收值.实验反复3次，取平均值，绘制螯合率随姜黄素浓度变化曲线.螯合率计算公式如下所示：

螯合率(%)=(1-A1/A0)×100

(1)

式(1)中，A1表示含有姜黄素样品液吸收值；A0表示姜黄素空白样吸收值.

第三，由于任务型语课堂要求学生有足够的时间进行探索和汇报并由教师做出反馈，学生的数量将导致课堂计划不能顺利进行。

1.6 统计学方法

所有的实验数据都表示为mean±SE.平均值用单向方差分析法(one-way analysis of variance，ANOVA) 和相应的学生t-检验(Student′s t-test) 进行统计学分析.统计学上P<0.05 认为差异有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 镉对肾脏脂质过氧化的影响

图1为镉诱导肾损伤的脂质过氧化程度.由图1可以看出，小鼠染镉7天后，镉损伤组体内MDA含量明显高于空白组(p<0.05)，在喂饲不同浓度的姜黄素以后，能够缓解体内MDA含量的升高(p<0.05)，而且随着姜黄素浓度的升高，当浓度为100 mg/kg/day，保护作用显著(p<0.001).这证明了镉的毒性可以诱发肾脏的脂质过氧化反应，同时姜黄素的保护作用与剂量呈依赖关系.

注:与空白组相比，*P<0.05；与镉损伤组相比,#P<0. 05，##P<0.01,###P<0.001.

2.2 肾脏的组织形态学

图2表示镉对肾脏的损伤作用及姜黄素的保护作用.由图2可以看出，在空白组中肾小管完整清晰，有完整的细胞结构，无炎症细胞侵润；在损伤组中肾脏出现水肿，没有完整的肾小管结构，细胞破裂，细胞核发生聚集现象，肾小球萎缩、退化，近端肾小管出现坏死，同时出现许多空泡及炎症细胞的侵润；而在姜黄素保护组，肾小管结构完整，无细胞皱缩以及炎症侵润，空泡现象明显减少，表明镉可以对肾脏造成损伤以及姜黄素对镉损伤具有保护作用.

(a)空白组

(b)镉损伤组

(c)保护组

2.3 元素分析结果检测

锌在细胞内含量丰富,参与细胞增殖、繁殖、免疫功能和防御自由基,锌作为一种抗氧化剂在保护细胞免受氧化损伤中起着重要的作用,同时影响新陈代谢和重金属毒性[12].镉进入机体后会与机体的一些必需元素发生竞争，造成体内一些必要离子的缺失，对机体造成损失[13],例如Zn2+、Cu2+、Ca2+等，镉、锌属同价离子 , 在肠道吸收过程中有强烈的竞争抑制作用.镉进入机体后会模拟二价离子如Zn2+、Cu2+的功能，利用或阻止一些酶的活性干扰细胞的代谢，当大量镉进入体内后会使体内锌重新分布，抑制锌的吸收而致体内锌含量降低，实验结果如表1所示.

表1 镉的毒性对肾脏内Cd2+、Zn2+含量的影响及姜黄素的保护作用

注:与Control(空白组)相比，**P<0.01，***P<0.001；与Cd(Ⅱ)(镉损伤组)相比，#P<0.05，##P<0.01.

通过表1可以看出，在小鼠肾脏中，损伤组镉含量显著增高(与空白组相比p<0.001),喂饲姜黄素后镉含量逐渐降低(与损伤组相比p<0.01)，而镉的毒性能够降低肾脏锌元素的含量(与空白组相比p<0.01)，在姜黄素的保护下，锌离子含量减少得到抑制(与损伤组相比p<0.01)，同时肾脏Cd2+、Zn2+的含量与姜黄素呈剂量依赖.有研究表明[14]Zn2+的减少可能是由于镉引起半胱天冬酶的聚集和细胞的凋亡，影响转录因子p53和p21造成的.

2.4 姜黄素金属螯合能力比较

图3为不同浓度姜黄素的金属螯合能力.由图3可以看出，姜黄素对Cd2+具有一定的螯合作用，并且随着实验中姜黄素浓度的增加，螯合作用逐渐增强，对Cd2+的螯合率也逐渐增大.当浓度为0.1 mg/mL时，姜黄素能迅速螯合游离的Cd2+，实验表明姜黄素可以剂量依赖的螯合Cd2+.

镉有很强的亲巯性，在肾脏中可以诱导金属硫蛋白生成镉-硫蛋白来保护机体的急性镉损伤[15].在本研究中能看到姜黄素可以剂量依赖的螯合体内游离的镉离子，证明姜黄素具有较强的金属螯合能力.姜黄素的金属螯合能力与其自身结构β-二酮基团有关，该基团可与金属离子鳌合形成有色水溶性的金属-姜黄素配合物[9].因此，姜黄素能够保护肾脏免受镉损伤是通过螯合体内游离的镉离子，减弱镉对生物大分子的损伤，起到类似于金属硫蛋白的作用.

图3 不同浓度姜黄素的金属螯合能力

3 结论

本实验通过构建急性染镉小鼠模型，研究镉对肾脏的损伤及姜黄素的保护作用.实验结果证明：

(1)镉对肾脏有损伤作用，可以破坏正常细胞形态，进而影响肾脏功能.

(2)镉进入机体后可以在肾脏蓄积，造成机体Zn2+含量的下降.

(3)姜黄素能够保护镉诱发的肾脏损伤，其保护作用与自身抗氧化及金属螯合能力有关.

本研究为姜黄素及其结构类似物研发新药提供科学依据.

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Protective effect of curcumin on cadmium-induced mice renal damage

GONG Pin1, BAI Xiao-huan1, CHEN Fu-xin2, MA Wei1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Xi′an University of Science & Technology, Xi′an 710054, China)

This research was designed to study the effect of curcumin on cadmium induced mice renal damage.Mice was treated by intraperitoneal injection of CdCl2(2 mg/kg/day) and lavage different concentrations of curcumin for 7 days.The content of MDA was used to test lipid peroxide (LPO) in mice and detect whether the model was built successfully,the renal histopathological changes induced by cadmium were observed using light microscope and the action mechanism of curcumin against the toxicity of Cd was explored by elemental content analysis and metal chelating assay.Results show that the intoxication of Cd can lead to the increase of vacuolus，the infiltration of inflammatory cells and the swelling of myocytes in damage group，however，the protective effect of curcumin can reduce the occurrence of histopathological changes.Meantime,element analysis results showed that the accumulation of cadmium in kidneys can,affect the absorption of essential elements,and curcumin show dose-response ability of chelating Cd2+,thereby inhibiting cadmium damage to kidneys.

cadmium; curcumin; chelating ability; kidney histopathological change

2015-03-11

国家自然科学基金项目(21407104,81402815)； 环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金项目(KF2012-05)； 陕西省教育厅专项科研计划项目(2013JK0767)

龚 频(1983-)，女，湖南邵阳人，讲师，博士，研究方向：药理生理

1000-5811(2015)03-0140-04

R99

A