刘 波 钟明艳 李庆萍 黄 敏 马熙天

淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能重要指标，它能总体反映机体当前的免疫功能、状态和平衡水平，我们通过测定肺腺癌患者化疗前后免疫功能的变化，为免疫治疗提供一定依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择从2013年4月－2015年6月我院住院的70例患者，男性40例，女性30例;年龄33～82岁，中位年龄55岁。所有患者经支气管检查取得病理、手术组织病理或经过CT引导下或B超引导下穿刺下取得明确病理诊断结果。根据化疗方法将患者分为培美曲塞组、多西他赛组，于化疗前及化疗结束后分别取静脉抗凝血2 m l和血清2 m l，抗凝血用于检测免疫活性细胞。

1.2 设备与方法

我院 CD3、CD4、CD8、CD4/CD8 及 NK 细胞特异性细胞固定及检测法，SemiBio细胞免疫芯片以细胞分离固定技术为基础，利用抗原抗体特异性反应，通过芯片基板达到将特异性细胞进行固定、分离的目的，完成检测。具体主要流程:(1)静脉标本血2 ml摇匀K2EDTA抗凝血加于相应编号380 ml磷酸盐缓冲液中，即刻混匀。(2)将湿盒置于水平台，加室温水至湿盒底部被完全覆盖。(3)取出玻片置于湿盒架上，将包被面朝上，按序将标签贴于玻片一端，后将玻片置于湿盒架上。(4)吸取5 ml稀释血样，滴入玻片方框区域中心。确认没有血样流出，且方框内无气泡，盖紧盒盖，湿温(20～30℃)孵育40 min。(5)孵育40 min后，将玻片按序插入玻片架。(6)将玻片架即刻放入磷酸盐缓冲液中，旋转提拉直至玻片呈无色透明。(7)将玻片架即刻放入过氧化酶染色中，静置1 min。(8)将1 ml 2.5% ～3.5%过氧化氢溶液加入预先盛有水(至400 ml刻度线)专用缸中，搅拌均匀后制成新鲜工作溶液中。(9)将稍加沥干的玻片架转入新鲜过氧化氢工作溶液中，静置4 min。(10)将玻片架转入75%乙醇(400 ml)专用缸中，旋转提拉直至干净，提出后振去多余乙醇。(11)打开玻片架搭扣，将其置入SemiBio自动玻片干燥仪下干燥6 min，确保黑框内干燥。(12)将玻片架放入复染液中，静置1 min。(13)将玻片架转入纯水(500 ml)专用缸中，静置30 s，其后根据玻片数量不等提拉相应次数，提出后振去多余水分。(14)打开玻片架搭扣将其置于SemiBio自动玻片干燥仪下吹干。(15)通过SemiBio全自动可视化细胞检测仪现场或异地随时进行细胞自动计数，重复步骤12-14。

1.3 统计学分析

用SPPSS19.0统计学软件数据进行分析，计量资料用均数标准差±s)表示，采用t检验或方差分析。

2 结果

(1)培美曲塞组化疗前后CD3明显增高(P＜0.05);CD4值增高(P ＜0.05);CD8明显降低(P ＜0.05);CD4/CD8升高，(P ＜0.05)，NK 值明显升高(P＜0.05)，见表1。(2)多西他赛组化疗前后 CD3、CD4值稍升高，但无明显统计学意义(P＞0.05);CD8值变化无明显统计学意义(P＞0.05);CD4/CD8比值稍升高，无明显统计学意义(P＞0.05)。NK值稍减低，无明显统计学意义(P＞0.05)，见表1。

多西他赛组与培美曲塞组化疗前后CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、NK变化比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05)(表2)。

表1 多西他赛组与培美曲塞组化疗前、后免疫指标的表达比较±s)

表1 多西他赛组与培美曲塞组化疗前、后免疫指标的表达比较±s)

指标多西他赛组培美曲塞组化疗前 化疗后 t P 化疗前 化疗后t P.74 70.90 ±3.35 －1.277 0.160 CD4 31.36 ±5.74 34.44 ±1.67 －6.765 0.000 34.66 ±1.62 35.10 ±2.75 －1.015 0.105 CD8 32.02 ±1.73 29.20 ±2.93 5.862 0.000 32.02 ±1.73 31.78 ±2.28 0.593 0.555 CD4/CD8 1.50 ±0.45 1.64 ±0.52 －2.784 0.005 1.45 ±0.68 1.56 ±0.78 －0.784 0.620 NK 19.64 ±2.70 21.67 ±2.78 －3.684 0.000 21.38 ±CD3 64.52 ±5.74 70.9 ±3.34 －6.784 0.000 68.5 ±5 2.93 22.18 ±2.87 －1.378 0.171

表2 培美曲塞组与多西他赛化疗前后的免疫指标变化值的比较±s)

表2 培美曲塞组与多西他赛化疗前后的免疫指标变化值的比较±s)

指标 培美曲塞组 多西他赛组t P CD3 6.38 ±7.15 0.14 ±4.10 5.354 0.000 CD4 3.08 ±3.04 －1.16 ±4.10 3.039 0.000 CD8 2.82 ±3.26 0.24 ±2.96 4.142 0.000 CD4/CD8 0.98 ±0.86 0.43 ±0.37 1.354 0.107 NK 2.02 ±3.36 0.80 ±4.09 3.770 0.000

3 讨论

培美曲塞是一种新的、多靶位叶酸拮抗剂，原理是通过细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制的代谢过程，从而抑制肿瘤的生长。多西他赛为紫杉醇类抗肿瘤药物，通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必须的微管网络而起抗肿瘤作用。Hanna等［1］应用培美曲塞VS多西他赛二线治疗NSCLC的Ⅲ期临床研究实验中证实在肺腺癌治疗中培美曲塞优于多西他赛，血液学毒性低于多西他赛，因此培美曲塞已经越来越多应用于治疗晚期肺腺癌。

T细胞在调节免疫系统中起重要作用［2］。CD3是CD4与CD8总和，CD4+T细胞包括调节T细胞，它在免疫反应中有免疫抑制和免疫调控作用［3］CD8+T细胞主要通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，又称细胞毒性细胞。CD4/CD8可作为NSCLC患者免疫紊乱指标［4］。在本研究中，通过多西他赛联合顺铂化疗后CD3、CD4、CD8、CD4/CD8比较均无统计学意义，表明多西他赛化疗后期免疫功能无明显下降;培美曲塞联合顺铂治疗后患者CD3、CD4、CD4/CD8值明显升高，CD8值明显降低，提示患者化疗后机体免疫得到优化，与国内一些学者所报道一致［5-6］其原因可能是化疗可能导致体内淋巴细胞总数降低，体内免疫自稳机制打破原有免疫耐受，各淋巴细胞亚群向正常过程重建，化疗使肿瘤细胞发生凋亡同时激活免疫应答，从而降低体内肿瘤负荷，重建T细胞免疫功能［7］。本研究中，使用培美曲塞的肺腺癌患者免疫增强原因可能是培美曲塞的疗效好于多西他赛，血液学毒性低，更有利于T细胞免疫功能重建，最终需进一步临床研究证实。

NK细胞可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)发挥杀伤性肿瘤细胞功能，还可通过分泌细胞因子、通过死亡受体介导靶细胞凋亡和释放穿孔素颗粒酶诱导凋亡等途径而杀伤肿瘤细胞［8］。化疗药物多为细胞毒性药物，在杀灭肿瘤细胞同时也杀伤机体正常增殖和分化细胞，尤其是杀伤增殖分化的免疫细胞。一般认为，NK细胞发挥效应多为中、早期肿瘤，对于晚期肿瘤，NK细胞难以发挥作用。本研究中，培美曲塞组化疗后NK细胞数增多，因为化疗后晚期肺腺癌肿瘤退缩较快，从而导致NK细胞增殖，使患者免疫功能增强。

综上所述，晚期肺腺癌免疫力低下，通过研究患者化疗前后免疫功能指标变化情况，可为针对性使用化疗用药提供理论基础，并进行针对性的免疫治疗。

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