甘秀海， 梁志远*， 周 欣， 赵 超， 卫 钢

(1. 贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵州 贵阳 550018；2. 贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001；3. 澳大利亚联邦科学与工业研究组织材料科学与工程分部，新南威尔士 2070)

高效液相色谱法同时测定百尾参中两种酰胺类化合物的含量*

甘秀海1， 梁志远1*， 周 欣2， 赵 超2， 卫 钢3

(1. 贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵州 贵阳 550018；2. 贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001；3. 澳大利亚联邦科学与工业研究组织材料科学与工程分部，新南威尔士 2070)

建立了同时测定百尾参中obtucarbamate A和obtucarbamate B两种酰胺类化合物含量的高效液相色谱分析方法，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，以甲醇-0.2%乙酸水(30∶70)为流动相，检测波长256 nm，流速1 mL·min-1，柱温30 ℃.结果表明：obtucarbamate A和obtucarbamate B分别在3～96 μg·mL-1和1～32 μg·mL-1范围内浓度与峰面积呈良好线性关系，其平均回收率分别为99.23 %和98.94 %，RSD分别为1.11 %和1.57 %.该方法操作简单，专属性强，灵敏度高，适用于百尾参中酰胺类化合物的含量测定.

百尾参；高效液相色谱；酰胺类化合物；含量测定

百尾参为百合科(Liliaceae)万寿竹属植物(Disporum cantoniense(Lour.)Merr.)的根茎.味甘、淡，性平，具有舒筋活血、清热祛痰止咳等功效[1]，为苗族习用药材，民间广泛应用于祛痰止咳，是咳速停系列止咳药物中的主药材之一.

文献报道百尾参中含有木犀草素、芹菜素等多种黄酮类化合物[2, 3]，本课题组研究发现百尾参中还含有较多的酰胺类化合物obtucarbamate A和obtucarbamate B，生物活性显示其具有明显的止咳活性，为百尾参药材止咳活性物质基础[4].而目前未见百尾参药材止咳活性成分含量测定及有关质量控制方面的报道.因此，为了保障百尾参药材的品质，进而控制咳速停系列止咳药物的内在质量，本实验采用高效液相色谱建立百尾参中obtucarbamate A和obtucarbamate B的含量测定方法，并测定不同产地百尾参药材中两种酰胺类化合物的含量，为完善百尾参药材的质量标准及百尾参药材和相关制剂质量的控制提供科学依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试药

1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；AL204电子分析天平，瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；DFY-200 高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司；DZF-6020真空干燥箱，杭州蓝天化验仪器厂；电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-50B型超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；obtucarbamate A和obtucarbamate B对照品，本课题组自制，纯度均大于99 %(HPLC归一化法测定)；百尾参样品于2012年8～10月采自贵州省境内(见表1)；甲醇，色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯.

表1 百尾参样品来源

1.2 对照品溶液的配制

精密称取恒重后的obtucarbamate A 15 mg、obtucarbamate B 5 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容得混合对照品储备液；再精密量取储备液溶液0.25、0.5、1、2、4、8 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得不同浓度的混合标准溶液.

1.3 供试品溶液的制备

百尾参干燥药材，粉碎，过40目筛，取粉末1.0 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL ×2，于40 ℃水浴下超声提取，每次30 min，滤过，合并有机相，浓缩，残渣用甲醇定容至25 mL，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得.

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-0.2 %乙酸水(30∶70)，柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：256 nm；进样量10 μL.

1.5 样品分析

在1.4项液相色谱条件下，分别将混合标准溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中分析，以保留时间定性，以峰面积定量.

2 结果与讨论

2.1 结 果

2.1.1 线性关系的考察 取1.2项下不同浓度的混合标准溶液，按1.4项下色谱条件进行测定，记录各浓度下的峰面积，以浓度(C)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析，分别得到回归方程Aobtucarbamate A= 198.12C+ 10.215，r= 0.999 8，Aobtucarbamate B=61.352C-6.891，r= 0.999 9.结果表明obtucarbamate A和obtucarbamate B分别在3～96 μg·mL-1、1～32 μg·mL-1范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系.

2.1.2 精密度实验 精密吸取1.2项下obtucarbamate A和obtucarbamate B浓度为24 μg·mL-1和8 μg·mL-1的混合标准溶液10 μL，按1.4项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，其RSD分别为1.6 %和1.3 %，表明仪器精密度良好.

2.1.3 稳定性实验 精密吸取1.2项下obtucarbamate A和obtucarbamate B浓度为24 μg·mL-1和8 μg·mL-1的混合标准溶液10 μL，按1.4项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录obtucarbamate A和obtucarbamate B的峰面积，其RSD分别为1.2 %和1.1 %，表明混合标准溶液在24 h内基本稳定.

2.1.4 重复性实验 精密称取同一批百尾参样品6份，按1.3项下方法制备供试品溶液，按1.4项下色谱条件分别进样10 μL，测定两种酰胺类化合物的峰面积并计算其含量，其RSD分别为1.3 %和1.5 %，表明该方法重复性良好.

2.1.5 加样回收率实验 精密称定6份已知obtucarbamate A和obtucarbamate B含量的百尾参样品约1.0 g，分别精密加入约等量的obtucarbamate A和obtucarbamate B混合对照品储备液，按1.3项中的方法制备样品溶液，按1.4项中色谱条件进行测定并计算回收率，结果表明两者的平均回收率为99.23 %和98.94 %，其RSD分别为1.11 %和1.57 %，结果见表2.

表2 obtucarbamate A和obtucarbamate B加样回收率测定结果(n=6)

2.1.6 样品含量测定 分别精密称取10批不同产地的百尾参样品1.0 g各三份，按1.3项下方法制得样品溶液，按1.4项下色谱条件进行测定，计算各样品中两种酰胺类化合物的平均含量.百尾参样品色谱图见图1，含量测定结果见表3.

表3 百尾参样品中obtucarbamate A和obtucarbamate B的含量(n=3)

Tab.3 The contents of obtucarbamate A and obtucarbamate B of Disporum cantoniense(n=3)

编号产地含量/(mg·g-1)obtucarbamateAobtucarbamateBS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10贵州思南贵州贵阳贵州安顺贵州独山贵州关岭贵州雷山贵州龙里贵州盘县贵州习水贵州玉屏0．4360．2180．9780．3900．6140．4460．4020．4280．3950．3670．1820．0980．3820．1150．2530．1910．1870．1930．1760．185

2.2 讨 论

2.2.1 色谱柱的选用 在色谱柱考察试验中，分别比较了样品在Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Phenomen kromasil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)等色谱柱中的色谱图.结果表明在Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)柱上供试品溶液及对照品溶液中两种酰胺类化合物的分离效果最好，吸收峰面积最大，基线平稳，且峰型对称性较高，故选择色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18进行含量测定.

2.2.2 提取方法的选择 在供试品溶液的制备中，考察了甲醇、乙醇及乙酸乙酯等为溶剂提取供试品，结果发现甲醇、乙醇及不同浓度的甲醇与乙醇以加热回流和超声所得供试品溶液中均含有较多的杂质峰，在相应的色谱条件下两种酰胺类化合物与其他峰很难达到有效分离，且峰高低，对称性差.乙酸乙酯加热回流所得样品溶液中，杂质峰较多；乙酸乙酯超声提取所得供试品溶液中各色谱峰分离较好，且峰高最大，对称性好.因此，以乙酸乙酯超声提取的方法来制备供试品溶液.

2.2.3 流动相的选择 流动相的选择中，分别考察了以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2 %乙酸水溶液、甲醇-0.2 %乙酸水溶液和乙腈-0.05 % 磷酸水溶液等为流动相对色谱图的影响，其中乙腈-水的体系，对照品出峰太快，很难与其他峰分开，只有在甲醇-0.2 %乙酸水溶液为流动相时，保留时间及分离度较满意，随后又考察了不同的比例，结果发现，甲醇-0.2%乙酸水溶液(30∶70)所得色谱图最佳.因此，确定了最佳的流动相为甲醇-0.2 %乙酸水(30∶70).

2.2.4 两种酰胺含量的差异 由表3可知，不同产地百尾参中两种酰胺的含量差异较大，如贵州安顺产的百尾参中obtucarbamate A和obtucarbamate B的含量分别为0.978 mg·g-1和0.382 mg·g-1，而贵州贵阳产的百尾参中相应的含量分别为0.218 mg·g-1和0.098 mg·g-1，两者相差约4倍，这可能与不同地域的土壤及气候条件差异有关.因此，在选择药材时，必须考虑不同地域间的环境差异对品质的影响，以确保药材及相应制剂的内在质量.

3 结 论

建立了百尾参中酰胺类化合物的高效液相色谱含量测定方法，并以此测定了不同产地百尾参药材中两种酰胺的含量.该方法操作简便、灵敏度高、专属性强，是百尾参中酰胺类化合物含量测定的一种有效方法，为今后该药材质量标准的完善及相关制剂的质量控制奠定了基础.

[1] 贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[M]．贵阳：贵州科技出版社, 2003: 162.

[2] CHEN L, SU Y F, YIN Z Y, et al. Flavonoids from Disporum cantoniense(Liliaceae)[J]. Biochem Syst Ecol, 2009, 37(5): 609.

[3] 甘秀海，周欣，梁志远，等．百尾参根的化学成分研究[J]．中国实验方剂学杂志，2013, 19(23): 140-142.

[4] 甘秀海，赵超，梁志远，等．百尾参止咳活性成分研究[J]．中国中药杂志，2013, 38(23): 4 099-4 102.

责任编辑：朱美香

Simultaneous Determination of Two Amides of Disporum Cantoniense by HPLC

GANXiu-hai1,LIANGZhi-yuan1*,ZHOUXin2,ZHAOChao2,WEIGang3

(1. School of Chemistry and Life Science, Guizhou Normal College, Guiyang 550018;2. Research Center for Quality Control of Natural Medicine, Guizhou Normal University,Guiyang 550001 China;3. CSIRO Materials Science and Engineering, NSW 2070 Australia)

An ananlytic method using high-performance liquid chromatograph(HPLC) for determination obtucarbamate A and obtucarbamate B of Disporum cantoniense was established. The determinination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) column, methanol-0.2% acetic acid aqueous solution(30∶70) as mobile phases at a flow rate 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 256 nm and the column temperature was 30 ℃. The results showed that the calibration curves of obtucarbamate A and obtucarbamate B had good linearity in the range of 3～96μg·mL-1and 1～32μg·mL-1, respectively. The average recoveries were 99.23 % (RSD=1.11 %) and 98.94 %(RSD=1.57 %), respectively. The method is simple, good specialization, high sensitive, and could be used to simultaneously determine amides of Disporum cantoniense.

Disporum cantoniense; HPLC; amides; content detemination

2015-02-17

教育部春晖计划项目(Z2011041)；贵州特色生物资源开发利用重点实验室项目(2012009)

梁志远(1959— )，女，福建 南安人，教授.E-mail:gzwh24000@sina.com

R917

A

1000-5900(2015)02-0086-05