陈建福 ， 林 洵 ， 陈美慧 ， 周媚媚

（1.漳州职业技术学院食品与生物工程系，福建 漳州 363000；2.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000；3.农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心，福建 漳州 363000）

佛手瓜[Sechium edule（Jacq.）Swartz]又名安南瓜、隼人瓜等，是葫芦科佛手瓜属珍稀瓜类蔬菜（Ordoñeza 等，2006）。黄酮类化合物是一类广泛存在于植物体中的多酚类物质，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血压、降血脂、延缓衰老等作用（Escriche 等，2014；Nakabayashi等，2014）。 本试验对影响超声波辅助提取佛手瓜总黄酮的工艺条件进行了研究，并利用响应面法对提取工艺进行了优化，得到了最佳的工艺条件，为佛手瓜资源的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 佛手瓜，购于漳州西洋坪菜市场。乙醇，分析纯，使用时，配制成不同浓度（体积分数）的乙醇溶液；芦丁，标准品；硝酸铝，分析纯；亚硝酸钠，分析纯；氢氧化钠，分析纯。

SCQ-3201E超声波清洗机，上海声彦超声波有限公司；LGJ10-C冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；Q-250B高速多功能粉碎机，上海冰都电器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；BSA124S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 佛手瓜总黄酮的测定 利用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品，测定在波长为510 nm时的吸光度，绘制标准曲线，得到吸光度与浓度的回归方程（陈建福和施伟梅，2014）。

利用上述方法测定佛手瓜提取液的吸光度，代入回归方程，得到总黄酮浓度，利用下式换算得到总黄酮提取率。

式中：m为佛手瓜的质量，g；b为回归方程计算的总黄酮质量浓度，mg/L；V为提取液体积，L。

1.2.2 超声波辅助提取佛手瓜总黄酮 将佛手瓜洗净切成条状，并泡于蒸馏水中0.5 h，捞起自然晾干后，冰冻，并于冷冻干燥机中进行干燥，粉碎，过80目筛备用。在装有冷凝管的250 mL三口烧瓶中，装入一定量的佛手瓜粉末，置于超声波反应器中，按照试验工艺条件对佛手瓜总黄酮进行提取，结束后，浓缩，定容，按1.2.1中的方法对总黄酮提取率进行计算。

1.3 单因素试验 固定其他条件不变，分别选取乙醇浓度（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、超声温度 （60、65、70、75、80、85 ℃）、 液料比（15、20、25、30、35、40 mL/g）、超声时间（15、20、25、30、35、40 min）等进行单因素试验，以总黄酮提取率为指标，研究各因素对佛手瓜总黄酮提取率的影响。

1.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上，以总黄酮提取率为响应值，选择乙醇浓度（A）、超声温度（B）、液料比（C）、超声时间（D）为工艺参数，运用Design Expert 8.05b软件，采用Box-Behnken中心组合原理设计试验，进行4因素3水平的响应面优化试验，建立响应值与因素间的预测模型，以确定最佳的工艺条件，响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验对佛手瓜总黄酮提取率的影响

2.1.1 乙醇浓度对佛手瓜总黄酮提取率的影响从表2可以看出，总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而增大，当乙醇浓度为70%时，总黄酮的提取率最大，当乙醇浓度超过70%时，提取率反而又下降，这是因为黄酮类物质具有一定的醇溶性，随着乙醇浓度的增加，黄酮类物质在溶剂中的溶解能力增强，因此总黄酮提取率提高。当乙醇浓度超过70%后，溶剂的极性变弱，部分强极性的黄酮溶出阻力增加，使得黄酮类物质提取率的下降（Zhang等，2011）。因此最佳的乙醇浓度选择为70%。

表2 提取条件对总黄酮提取率的影响

2.1.2 超声温度对佛手瓜总黄酮提取率的影响从表2可以看出，总黄酮提取率随着超声温度的升高而增大，当超声温度为70℃时，总黄酮提取率最大，当超声温度超过70℃时，提取率反而下降，这是因为随着超声温度的升高，提取体系的分子热运动增强，促进了总黄酮与溶剂之间的扩散与交换（Xie等，2014），从而使得总黄酮提取率增大，但当超声温度超过70℃时，高温会使黄酮类物质破坏与分解，从而导致总黄酮提取率的下降。因此最佳的超声温度选择为70℃。

2.1.3 液料比对佛手瓜总黄酮提取率的影响 从表2可以看出，总黄酮提取率随着液料比的增加而增大，当液料比为25 mL/g时，总黄酮提取率最大，当液料比超过25 mL/g时，提取率反而下降，这是因为随着液料比的增大，佛手瓜颗粒内外的浓度差增大，使得传质推动力增加，促进了黄酮从颗粒内部溶出，而使得总黄酮提取率增大，当液料比超过25 mL/g后，溶剂量过大，溶剂会增加超声能量的损耗且会增加后序浓缩中黄酮的损失（A-boshora等，2015），而使得总黄酮提取率下降。因此，最佳的液料比选择为25 mL/g。

2.1.4 超声时间对佛手瓜总黄酮提取率的影响从表2可以看出，总黄酮提取率随着超声时间的延长而增大，当超声时间为30 min时，总黄酮提取率最大，当超声时间超过30 min时，提取率反而下降。这是因为随着超声时间的延长，佛手瓜颗粒中的黄酮类物质逐渐溶出，使得总黄酮提取率增大，但超声时间过长，超声会产生局部的高温而造成部分黄酮类物质的分解 （Teh和 Birch，2014），而导致总黄酮提取率的下降。因此最佳的的超声时间选择为30 min。

2.2 响应面法优化超声辅助提取佛手瓜总黄酮的工艺

2.2.1 响应面试验设计与结果 利用Design Expert 8.05b软件对表3的试验结果进行响应面分析，根据Box-Behnken中心组合试验设计，得到了佛手瓜总黄酮提取率对乙醇浓度、超声温度、液料比和超声时间的二次多项式回归方程：

Y=3.35-0.12A+0.34B+0.13C+0.14D+0.18AB-0.047AC-0.13AD+0.05BC-0.017BD+0.002CD-0.3A2-0.61B2-0.57C2-0.48D2。

回归模型的方差分析如表4所示。由表4可以看出，该回归模型F=19.81，P＜0.0001，说明该模型极显著，与试验拟合较好。失拟项P=0.3113＞0.05，差异不显著，表明未知因素对本试验的干扰较小，残差是由随机误差引起的。相关系数R2=0.9519，表明该模型有超过95%的试验值可用预测值来代替，说明预测值与实际值之间的相关性较好。从回归方程的F值及P值可看出，一次项B、D，二次项 A2、B2、C2、D2对试验结果影响极显著（P ＜ 0.01），一次项 A、C，交互项AB 对试验结果影响显著（P ＜ 0.05），交互项 AC、AD、BD、CD 对试验结果影响不显著（P＞0.05），说明各因素与佛手瓜总黄酮提取率之间不是简单的一次线性关系，而是呈二次关系，影响因子的主效应主次顺序为：超声温度>超声时间>液料比>乙醇浓度。综上所述，利用响应面法建立的回归模型拟合度高，可较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，因此可以用该模型预测和分析超声辅助提取佛手瓜总黄酮的工艺条件。

2.2.2 响应面分析 根据表3的结果作出的响应面分析图及等高线图如图1所示。从图1可以看出，超声温度和超声时间的曲线较陡，说明超声温度和超声时间对总黄酮提取率的影响最为显著；而液料比和乙醇浓度的曲线均较平缓，响应值变化较小，说明液料比和乙醇浓度对总黄酮提取率的影响较小。分析可知，主次因素顺序为超声温度＞超声时间>液料比＞乙醇浓度。

表3 响应面设计方案及试验结果

2.2.3 提取工艺优化及结果验证 在所选取的各因素条件范围内，通过Design Expert 8.05b软件对二次回归模型进行数据分析，得到超声波辅助提取佛手瓜总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度69.15%、超声温度71.27℃、液料比25.66 mL/g、超声时间31.64 min，在此条件下，佛手瓜总黄酮提取率的最大理论值为3.420%。为了验证响应面法的可靠性，并考虑到实际操作条件的便利性，将工艺条件修正为：乙醇浓度69%、超声温度71℃、液料比25 mL/g、超声时间31 min。以此为条件进行三次平行验证试验，测得佛手瓜总黄酮平均提取率为3.402%，与理论预测值3.420%相差较小，相对误差为0.526%，说明通过响应面法优化得到的佛手瓜总黄酮的回归模型拟合度高，具有实际的生产价值。该工艺与杨海涛（2008）报道的传统的热浸提法（乙醇浓度70%、料液比1∶20，温度80℃，提取时间2 h）相比，提取率提高了12.69%，该工艺大大缩短了操作时间，且操作温度低，具有明显的成本优势，是一种高效快速提取佛手瓜总黄酮的方法。

表4 回归模型方差分析

3 结论

试验利用BoX-behnken Design设计方案，运用Design Expert 8.05b软件对工艺参数进行了优化，得到了佛手瓜总黄酮提取率与各因素间的四元二次回归方程。根据回归模型确定了超声辅助提取佛手瓜总黄酮的最佳工艺参数为：乙醇浓度69%、超声温度71℃、液料比25 mL/g、超声时间31 min。在该工艺条件下进行验证试验，测得佛手瓜总黄酮平均提取率为3.402%，与理论预测值（3.420%）相差较小，相对误差为0.526%，说明通过响应面法优化得到的佛手瓜总黄酮提取的工艺参数准确可靠。

图1 两因素交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图

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