岩龙胶囊对Lewis肺癌小鼠Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1表达的影响

2015-04-26卢秀梅吴万垠

亚太传统医药 2015年9期

关键词：低剂量批号阴性

卢秀梅，李岩，李翎，吴万垠

(1.香港岩龙中医药有限公司，中国香港；2.广州中医药大学第一附属医院实验中心，广东广州 510405;3 广东省中医院，广东广州 510120)

岩龙胶囊对Lewis肺癌小鼠Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1表达的影响

卢秀梅1，李岩1，李翎2，吴万垠3

(1.香港岩龙中医药有限公司，中国香港；2.广州中医药大学第一附属医院实验中心，广东广州 510405;3 广东省中医院，广东广州 510120)

目的：研究岩龙胶囊对Lewis 肺癌荷瘤小鼠瘤细胞的Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1的表达，探索其抑瘤机制。方法：将40只Lewis 肺癌瘤株转染成功的C57BL/6小鼠随机分为四组: 岩龙胶囊高剂量组、岩龙胶囊低剂量组、阳性对照组、阴性对照组各10只。造模第4天，岩龙胶囊两组均灌胃中药，阳性对照组腹腔注射顺铂注射液，阴性对照组用等体积生理盐水灌胃，均每天1次，共给药10天,并记录小鼠一般情况，造模第14天处死小鼠，测取各项指标。结果：与阴性对照组比较，岩龙胶囊高剂量组和阳性对照组的瘤重明显减小，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。岩龙胶囊高、低剂量组和阳性对照组的抑瘤率分别为19.41%、8.68%、39.34%。与阴性对照组比较，岩龙胶囊高剂量组和阳性对照组的肺转移结节数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。岩龙胶囊高、低剂量组和阳性对照组的肺转移抑制率分别为40%、32.4%、53.3%。与阴性对照组比较，岩龙胶囊高剂量组和阳性对照组能明显降低Bcl-2和CyclinD1的表达，并能提高Caspase-3的表达，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.001，P<0.05)。结论：岩龙胶囊对Lewis肺癌小鼠有一定的抑瘤和抗转移作用,机制可能与降低Bcl-2和CyclinD1的表达，提高Caspase-3的表达有关。

岩龙胶囊； Lewis 肺癌；Bcl-2；Caspase-3；CyclinD1;表达

岩龙胶囊是中医肿瘤专家李岩教授所研制,其配方用于恶性肿瘤临床与实验研究有20余年，适用于多种常见恶性肿瘤。该方由蛇莓、龙葵等复方中药组成，功能以清热解毒化瘀为主，扶正为辅。既往Ⅰ期实验证实岩龙胶囊对Lewis肺癌瘤株转染的C57BL/ 6 小鼠有抑瘤和抗肺转移作用[1],并能提高小鼠的CD4表达和降低CD44V6表达[2]。本次Ⅱ期实验进一步研究岩龙胶囊对这类小鼠的Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1表达的影响，探讨其抑瘤和抗转移的作用机制。

1 材料及方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠，动物许可证号：SCXK(粤)2008-0002。小鼠和SPF级鼠饲料购自广东省医学实验动物中心。小鼠常规饲养，自由饮水。

1.2 实验环境

动物房室温20～25℃，湿度40%～70%，实验环境设施许可证号：SYXK(粤)2008-0092。

1.3 药物

1.3.1 受试药物岩龙胶囊由广东岩龙肿瘤防治研究所提供，批号：120208。临床用量：2.7g/天(3次/天，3粒/次，0.3g/粒),小鼠等效剂量：0.55g/kg。给药剂量：岩龙胶囊高剂量：等效剂量8倍, 即4.4g/kg；岩龙胶囊低剂量：等效剂量4倍, 即2.2g/kg。给药剂量及方法：0.5mL灌胃给药，每日1次。

1.3.2 阳性对照药顺铂注射液(DDP)，南京制药厂有限公司，批号：20110401，国药准字：H20030675。顺铂注射液为疗效可靠、抗瘤谱广的药物，适用于小细胞与非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肉瘤、头颈部肿瘤及各种鳞状上皮癌和恶性淋巴瘤等的治疗。给药剂量及方法： 0.001g/kg，腹腔注射。

1.3.3 阴性对照生理盐水，四川科伦药业股份有限公司，批号：T1206011。剂量及方法：0.5mL灌胃，每日1次。

1.4 试剂与仪器

流式细胞试剂Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (PE Conujgate)(Cell Signaling Technology，批号：1212012)；BCL-2(C-2)PE(Santa Cruz Biotechnology，批号：G3009)；RbmAb to Cyclin D1 (SP4) (FITC) (abcam , 批号：GR84529-1)；Goat Anti-Rabbit IgG-PE(二抗)，(Santa Cruz Blotechnology，批号：B1412)；TritonX-100 (华美生物工程公司，批号BR2681)；甲醛 (广州市中南化学试剂有限公司，批号：310609)；冰醋酸 (天津市永大化学试剂有限公司，批号：20100818)；苦味酸 (广州化学试剂厂，批号：20081201-1)；无水乙醇(天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20120206)；AE200型电子分析天平(Mettler)；微量移液器(日本NICHIRYO)；T25B型组织分散机(马来西亚JKIKA WORKS)；TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器公司)；流式细胞仪(美国BECKMAN COULTE公司 ALTRA型，四色荧光，配套EXPO 32 采集分析软件)。

1.5 实验方法

1.5.1 动物造模[3]使用已冷存的Lewis肺癌细胞，按每只小鼠0.2mL(约含活细胞 1 × 107个)接种于6～8周龄的C57BL/6小鼠背侧皮下。

1.5.2 实验分组及给药将有肿瘤生长的小鼠随机分组：岩龙胶囊高、低剂量组，阳性对照组，阴性对照组。每组10只。造模第4天，开始灌胃给药，每天1次，共给药10天。用药后观察小鼠一般情况。造模第14天，处死小鼠，测瘤重，计算抑瘤率；切取瘤体组织测Bcl-2、Caspase-3、CyclinD1，计数肺表面转移结节数。

抑瘤率(%)=(对照组瘤重平均值-用药组瘤重平均值)/对照组瘤重平均值×100%

肺表面转移结节数观察方法：将肺组织于Bouin’s固定液(饱和苦味酸-甲醛-冰醋酸=75∶25∶5)中固定24h，再用无水乙醇浸泡至肺组织颜色恢复，转移灶为白色结节，记录肺转移瘤灶的数目。

肺转移抑制率(%)=(对照组平均肺表面转移结节数-治疗组平均肺表面转移结节数)/对照组平均肺表面转移结节数×100%

瘤体处理：切取瘤体组织约5g，于培养皿上以100目不锈钢滤网上研磨，以PBS液反复滤过冲洗10次，滤液经300目滤纸过滤至流式管中，离心1 200rpm×5min，弃上清。加入2mL PBS液吹打分装成3管，离心1 200rpm×5min，弃上清，分别作Bcl-2、Caspase-3、CyclinD1检测用。

Bcl-2检测方法[4]：于样品中加入1mL 2%多聚甲醛固定，放置15min，离心(1 200rpm× 5min)，加入1mL 0.1%TritonX-100(破膜剂)，放置15min，离心弃上清液，加入BSA 2mL洗涤，离心弃上清液，加入Bcl-2抗体(1∶50稀释)100μL，混匀，室温放置20min，加入BSA 2mL洗涤1次，弃上清液，加入1mL PBS上流式细胞仪检测。

Caspase-3检测方法[5]：于样品中加入1mL 2%多聚甲醛固定，放置15min，离心(1 200rpm× 5min)，加入1mL 0.1%TritonX-100(破膜剂) ，放置15min，离心弃上清液，加入BSA 2mL洗涤，离心弃上清液，加入Caspase-3抗体(1∶50稀释)100μL，混匀，室温放置20min，加入BSA 2mL洗涤一次，弃上清液，加入二抗(1∶50稀释)5μL，混匀，室温放置20min，加入BSA 2mL洗涤1次，弃上清液，加入1mL PBS上流式细胞仪检测。

CyclinD1检测方法[6]：于样品中加入1mL 70%乙醇固定，放置15min，离心(1 200rpm×5min)，加入1mL 0.1%TritonX-100(破膜剂) ，放置15min，离心弃上清液，加入BSA 2mL洗涤，离心弃上清液，加入CyclinD1抗体(1∶50稀释)100μL，混匀，室温放置20min，加入BSA 2mL洗涤一次，弃上清液，加入1mL PBS上流式细胞仪检测。

1.6 统计学方法

2 结果

四组小鼠移植瘤株后存活并生长。

2.1 瘤重和抑瘤率

岩龙胶囊对Lewis肺癌细胞荷瘤小鼠干预治疗后，高剂量组和阳性对照组的瘤体重量明显减小，与阴性对照组对比，分别为P<0.05和P<0.001。低剂量组与阴性对照组对比差异无统计学意义。岩龙胶囊高、低剂量组和阳性对照组的抑瘤率分别为19.41%、8.68%、39.34%。详见表1。

表1 岩龙胶囊对肺癌小鼠瘤体重量和抑瘤率的影响 (n=10)

注：与阴性对照组比较：*P<0.05 ，***P<0.001。

2.2 肺转移结节数和肺转移抑制率

岩龙胶囊对Lewis肺癌细胞荷瘤小鼠干预治疗后，高剂量组和阳性对照组的肺转移结节数明显减少，与阴性对照组对比，分别为P<0.05和P<0.001。低剂量组与阴性对照组对比差异无统计学意义。岩龙胶囊高、低剂量组和阳性对照组的肺转移抑制率分别为40%、32.4%、53.3%。见表2。

表2 岩龙胶囊对肺转移结节和肺转移抑制率的影响 (±s)

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，***P<0.001。

2.3 Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的表达

岩龙胶囊对Lewis肺癌细胞荷瘤小鼠干预治疗后，高剂量组和阳性对照组能明显降低细胞凋亡抑制基因Bcl-2和细胞周期蛋白CyclinD1的表达，同时能提高细胞凋亡基因Caspase-3的表达。岩龙胶囊高剂量组与阴性对照组比较，对Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的影响中P值分别为P<0.01、P<0.001、P<0.05。阳性对照组与阴性对照组比较，对Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的影响中P值分别为P<0.001、P<0.001、P<0.01。低剂量组与阴性对照组比较差异无统计学意义。详见表3。

表3 岩龙胶囊对肺癌小鼠Bcl-2、Caspase-3及CyclinD1表达的影响 (±s，n=10)

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨论

岩龙胶囊的组方体现了李岩教授早在20多年前中医肿瘤组方的特点，不但考虑整体观念，而且重视“辨证与辨病”相结合。Ⅰ期和Ⅱ期实验结果均表明了岩龙胶囊对Lewis肺癌细胞荷瘤小鼠有一定的抑制肿瘤生长和抗肺转移作用。然而，岩龙胶囊的组方是针对多种恶性肿瘤使用的，在“辨证”上是以蛇莓、龙葵、白英同为君药，以当归、郁金、丹参同作臣药和佐药之用，共奏以清热解毒化瘀为主、扶正为辅之功。在“辨病”的抗癌作用上，既往大量实验证明方中各药均有较强的作用，如蛇莓水提物抗人体肝癌(7721)、胃癌(7901)、食管癌(Eca109)、卵巢癌(SKOV-3)、宫颈癌(Hela)、子宫内膜癌(HEC-1B)、鼻咽癌(BGC-823)、肺癌(NCI-H460)等癌细胞；龙葵抗乳腺癌(MCF-7)、肝癌(SMMC-7721，HepG2)、胃癌(MGC-803)、肉瘤(S180)等癌细胞；白英抗卵巢癌(HO-8910)、宫颈癌(Hela)、肉瘤(S180)(肝癌H22)、白血病(K562)、鼻咽癌(HONE-1)、口腔上皮癌(KB)、肠癌(HT29)等癌细胞；郁金抗白血病(HL60、K562)、胃癌(SGC 7902、MGC 803)、肝癌(Bel 7402)、结肠癌(SW620)等癌细胞；丹参抗舌癌(TCA-83)、肝癌(Ang-2、HepG2)、乳腺癌(MDA-MB-231)、肺癌(NCI-H460)、肠癌(LoVo)、宫颈癌(Hela)胆管癌(HCCC-9810)、前列腺癌(DU145)、子宫内膜癌(KLE)等癌细胞。因此,本方对多种恶性肿瘤都有较好的疗效。

Bcl-2基因家族是与细胞凋亡有关的基因，包括Bcl-2、Bcl-X和Bax，三者形成细胞调亡的其中一个调控系统，其中Bcl-2属抗调亡基因，其表达的产物可增加多种促调亡因素的抗性，而延长细胞的寿命。其抑制调亡的机制可能与下列因素有关：①抗氧化作用，抑制细胞超氧化物的积累；②与Bax的产物形成异源二聚体Bax/ Bcl-2后，等于减少了导致细胞调亡的Bax/Bax同源二聚体的形成；③影响细胞内Ca2+重新分布，而抑制了某些Ca2+依赖的酶发挥酶解活性[7]。本实验中岩龙胶囊能明显降低该基因的表达，提示岩龙胶囊可以通过降低Bcl-2以促进癌细胞凋亡，可作为其抑制肿瘤一种机制。

Caspase-3基因是与细胞凋亡有关基因的ICE家族(Caspase-1 ～11)中的一员。该家族的成员都具有胱氨酸蛋白酶的活性，可促使细胞调亡。Caspase的激活途径有两个：①死亡受体途径：细胞表面Fas、TNF-α、TRAIL受体与相应配体结合后，可通过活化相关死亡结构域及死亡效应域，顺应激活Caspase-8和Caspase-10、Caspase-6、Caspase-7，最后是Caspase-3而导致细胞调亡；②线粒体途径：细胞内细胞色素C凋亡交互因子(CIFA)分解线粒体中细胞色素C后，细胞色素C与Caspase(Apaf-1)结构域中的P环结合，并激活Caspase-9，再激活Caspase-3而导致细胞调亡[7]。实验中岩龙胶囊能明显提高该基因的表达，提示岩龙胶囊可以通过提高Caspase-3以促进癌细胞凋亡，可作为其抑制肿瘤的另一种机制。

CyclinD1是细胞周期蛋白中CyclinD家族中的三个亚型(D1、D2、D3)之一，是肿瘤细胞正调控因子，调节细胞周期从G1期向S期的转换。CyclinD1与CDK4或CDK6形成复合物后激活CDK,并通过磷酸化其下游关键底物Rb,使其释放出结合的转录因子E2F,促进DNA转录，使细胞跨过G1-S监测点而促进细胞增殖。正常组织中CyclinD1表达较低或不表达，而肿瘤组织中常有CyclinD1的扩增、重排、以及突变，导致蛋白表达产物增多，是多种恶性肿瘤发生的一个重要的因素[8]。本实验中岩龙胶囊能明显降低该基因的表达，提示岩龙胶囊可以通过降低CyclinD1以降低癌细胞增殖，可作为其抑制肿瘤的一种机制。

综上所述，结合两期实验结果，岩龙胶囊对CD4、CD44V6、Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1的干预，表明了其对恶性肿瘤的抑瘤机制是多角度和多靶点的，也反映了中医中药治疗恶性肿瘤的复杂机制。

[1] 卢秀梅,吴万垠.岩龙胶囊对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用研究[J].中国医药指南，2013，11 (1)：462-464.

[2] 卢秀梅.李岩防治肿瘤学术思想及岩龙胶囊对Lewis肺癌的作用 [D]. 广州：广州中医药大学，2013.

[3] 李春艳,王颖,刘浩,等.C57BL/6 近交系小鼠 Lewis 肺癌动物模型: 建设性描述肺癌损害程度的指标[J].中国临床康复,2003, 7(26) :3582-3583．

[4] 解丽君,赵松,郝娜,等.亚慢性摄入酒精诱导大鼠生精细胞凋亡及其分子机制研究[J]. 毒理学杂志, 2011，25(6):402-405

[5] 李威,易银,吴昊,等.Ⅲ型干扰素信号通路诱导肺癌细胞凋亡的机制研究[J].北京医学, 2011，33 (12):989-992.

[6] 朱艳琴,王凯娟.苦参素注射液对Eca-109细胞周期及CyclinD1、CDK4蛋白表达的影响[J].郑州大学学报：医学版,2008，43(6):1082-1085.

[7] 杨吉成.现代肿瘤基因治疗实验研究方略[M].北京：化学工业出版社，2008：23-26.

[8] 孙晓杰,李珅.肿瘤分子诊断与靶向治疗[M].上海：第二军医大学出版社，2009：79-81.

(责任编辑：宋勇刚)

2014-11-23

卢秀梅(1974-),女,博士,研究方向为中医治疗肿瘤。