吴高峰，黄占旺，刘宛玲，牛丽亚，黄永平，王素贞

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

纳豆菌制剂及纳豆冻干粉成分比较分析

吴高峰，黄占旺＊，刘宛玲，牛丽亚，黄永平，王素贞

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

对发酵纳豆主要营养成分进行测定，同时对大豆粉、纳豆和纳豆菌制剂的营养成分进行对比分析，探究纳豆发酵过程中各种主成分的变化。结果表明，与大豆粉相比，纳豆冻干粉的氨基酸态氮和灰分含量显著增加（p<0.05），粗纤维、粗脂肪和水分含量显著减少（p<0.05）。而与纳豆菌液体培养产物相比，纳豆菌制剂中的粗蛋白含量极显著增加（p<0.01），氨基酸态氮和灰分含量显著增加（p<0.05），水分含量极显著减少（p<0.01），粗纤维含量显著降低（p<0.05）。此外，经发酵过程后，纳豆菌制剂和纳豆冻干粉的纳豆激酶含量增加，纳豆冻干粉的大豆异黄酮和植酸含量极显著降低（p<0.01），维生素K2含量显著降低（p<0.05）。试验证明，纳豆菌制剂和纳豆冻干粉比大豆粉更具有营养价值。

大豆，纳豆冻干粉，纳豆菌制剂，成分分析

纳豆是日本的传统发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵大豆制成的，不仅保有大豆的营养价值，而且还富含维生素K2等活性成分，能有效提高蛋白质的消化吸收率，具有溶解体内纤维蛋白、防治“三高”、溶血栓、醒酒等功能[1]。目前，大豆营养保健成分是大豆研究的热门，然而国内关于纳豆的研究不多。陶湘林等[2]研究了一种日本纳豆粉的成分，对主要营养成分以及纳豆激酶和大豆异黄酮的含量进行了测定，发现纳豆激酶活力为5062.5 U/g，大豆异黄酮含量为390 μg/g。齐凤兰等[3]对纳豆中的活性成分进行了研究，着重研究了不同因素对纳豆激酶活力的影响以及氨基酸组成。祖国仁等[4]对纳豆菌固体发酵产物纳豆进行测定，其中纳豆激酶活力达到670.15 IU/g，并对纳豆进行了感官评定。周建平等[5]对三种纳豆菌制作的纳豆及其产品的粘液与蒸煮大豆进行营养成分分析。由于其在发酵后氨味很重，这种独特风味和气味，使得很多人无法接受，因此在我国尚未进行广泛地研究和利用。

纳豆菌有强烈的耐酸、耐高温的特性，它能直达肠道，帮助肠道正常工作，并且辅助通便。它能够产酸，调节肠道菌群以及增强免疫抵抗能力。目前纳豆生产多采用直接接种纳豆芽孢杆菌发酵大豆，此法产量小且不方便。采用纳豆芽孢杆菌制成纳豆菌制剂作为直投式发酵剂，较以前采用纳豆芽孢杆菌种子液接种蒸煮大豆进行发酵的方法更方便，更适宜工业化生产[6]。

然而，目前很多研究只对单一的纳豆及制品进行分析，本实验采用纳豆芽孢杆菌接种大豆制成纳豆，对大豆、纳豆冻干粉及其纳豆菌制剂基本成分和营养成分进行系统对比分析，以期为纳豆的进一步开发利用提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

大豆 2级长江流域春夏大豆，用来制作纳豆和大豆粉；液态发酵和固态发酵发酵剂纳豆芽孢杆菌江西农业大学食品院天然产物重点实验室保藏；大豆异黄酮标品、维生素K2标品、酪蛋白标品和L-酪氨酸标品、植酸标品 纯度≥98%，阿拉丁（上海）试剂公司。

阴离子交换树脂（AG1-X4） 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；XSP-2C型生物显微镜 上海光学仪器一厂；1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；TDL-5-A低速大容量离心机和TGL-20000CR高速台式冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；1B-1500A型高速多功能粉碎机 上海力箭机械有限公司；SB-3200超声振荡机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Scientz-10N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；PHB-5型pH计 精度0.02，杭州雷磁分析仪器厂；UV-5200PC型紫外-可见分光光度计 上海元析仪器股份有限公司；DW-86L628型立式超低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；SPX-250-型生化培养箱 苏州学森仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 纳豆菌制剂制备

1.2.1.1 纳豆菌培养液的制备流程 培养基的配制（牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠0.5%，加水至所需体积，固体培养基加入2%琼脂）及灭菌（121℃，40 min）平板划线分离→纯种培养（37℃，24 h）→制菌悬液→稀释平板计数→纳豆菌液体培养产物。

1.2.1.2 纳豆菌镜检 采用直接涂片法，将纳豆菌梯度稀释，取稀释样品涂片、革兰氏染色，油镜观察并计数拍照。

1.2.1.3 纳豆菌制剂制备 取100 mL液体培养基，接入四环纳豆菌纯种，培养16～18 h后制成纳豆菌液体培养产物并测定活菌数。将其转入灭菌的铁盘，加入15%灭菌脱脂奶粉，真空冷冻干燥制成纳豆菌制剂，称重，根据刘慧等[7]采用标准活菌计数法测定活菌数。

1.2.2 纳豆冻干粉的制备

1.2.2.1 纳豆的制备 取200～300 g大豆，洗净浸泡24 h并不断换水，个体饱满后在121℃下蒸煮40 min，用手可以捏碎方可，然后将其放在无菌托盘中摊凉至双手触碰不感觉烫，均匀加入蒸煮后大豆质量的10%的上述菌液于大豆表面，充分混匀，在40～42℃生化培养箱中固体发酵24 h，然后将其转入4℃冰箱后熟12 h，观察大豆表面产生黏液，并用无菌勺子检验拉丝，黏液和拉丝体现了纳豆菌发酵的强度，黏液越多、拉丝越长表明发酵越成功。

1.2.2.2 纳豆冻干粉的制备 将上述制备好的纳豆加保护剂（15%脱脂奶粉），真空冷冻干燥后，用高速多功能粉碎机粉碎，制成纳豆冻干粉。

1.2.2.3 活菌数测定 对纳豆菌液体培养产物、纳豆菌制剂、纳豆以及纳豆冻干粉按照1.2.1.3的方法进行活菌数测定，每个组做5个平行。

1.2.2.4 纳豆菌生长以及纳豆发酵好坏的测定 将纳豆菌平板划线和发酵完成的纳豆进行拍照，然后进行纳豆菌生长和纳豆发酵结果分析。

1.2.3 大豆粉的制备 称取300 g大豆，采用高速多功能粉碎机10000 r/min粉碎2 min，收集大豆粉待用。

1.2.4 营养成分的测定 由于纳豆菌制剂和纳豆冻干粉都添加奶粉作为冻干保护剂，而纳豆是由纳豆菌发酵大豆而来，另外纳豆菌液体培养产物添加奶粉进行冻干即为纳豆菌制剂，所以对奶粉、大豆粉、纳豆菌液体培养产物、纳豆菌制剂、纳豆和纳豆冻干粉进行各项成分的比较。具体成分检测方法如下：

粗蛋白的测定采用微量凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003第一法）；粗脂肪的测定采用索氏提取法（GB/T 5009.6-2003）；总糖的测定采用还原糖测定法以及转化还原糖测定法；水分的测定采用直接干燥法（GB/T 5009.3-2003第一法）；灰分的测定采用直接灰化法（GB/T 5009.4-2003）；氨基酸态氮的测定采用双指示剂甲醛滴定法；粗纤维的测定采用硫酸水解法（GB/T 5009.10-2003）；纳豆激酶活性的测定采用福林法（GB/T 23527-2009附录B）；大豆异黄酮测定采用高效液相色谱法（GB/T 26625-2011）；植酸的测定采用离子交换分离，分光光度法（GB/T 5009.153-2003）；维生素K2的测定采用反相高效液相色谱法[8]。

1.2.5 冻干粉保藏试验 由于上述实验过程需要40～50 d，所以必须对冻干粉进行保藏试验，以确定冻干粉活菌数不会发生显著性的变化。将纳豆菌制剂和纳豆冻干粉储存于自封袋中置于4℃、15℃和室温条件下从0 d起每隔10 d测定活菌数的变化。

2 结果与分析

2.1 纳豆菌生长图及纳豆发酵结果

图1 纳豆菌生长图及纳豆发酵结果Fig.1 Growtn of Bacillus natto and fermentational resultof natto

根据图中划线平板培养图并挑取芽孢进行镜检，查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]，纳豆芽孢杆菌芽孢中生且为椭圆或圆柱形，革兰氏染色为紫色，培养基上芽孢有褶皱，中间较四周白。可知，此菌株为纳豆芽孢杆菌，并且细菌数量巨大，可判定为纳豆芽孢杆菌纯种。图中的b和c可以看出发酵大豆制成的纳豆外表粘稠有一层白霜且色泽呈现金黄色，氨味很重且纳豆香味明显，口感润滑细腻，拉丝明显且很长，质量好。

2.2 纳豆产品活菌数

图2 纳豆菌培养产物和纳豆产品活菌数测定结果图（n=5）Fig.2 Viable bacteria measurement results of Bacillus natto culture and natto product（n=5）

图2可以看出，纳豆冻干粉的活菌数最高，达到9.44×1010cfu/g，极显著高于其它各组（p<0.01），而纳豆菌液体培养产物的活菌数最低，只有1.34×1010cfu/g，并且冻干粉的活菌数均高于对应的非冻干粉组。因此，纳豆芽孢杆菌和纳豆经过加工后的活菌数都会有所提高，并且制成的冻干粉更加适合用于后续试验，易于保存且使用方便。

2.3 基本成分分析结果

从表1可以看出，对于粗蛋白，大豆粉的含量最高，纳豆菌制剂较纳豆菌液体培养产物极显著升高（p<0.01），纳豆冻干粉较大豆粉降低。这表明在加工过程中，粗蛋白的含量的降低对于素食主义者以及消化不良的人群对蛋白质的摄入需求有很大的帮助[10]。另外粗蛋白食物不利于降低肠道有害菌群的增殖，能改善肠道健康状况。

纳豆冻干粉的粗脂肪含量较大豆粉显著降低（p<0.05），由于纳豆菌是好养微生物，在生长过程中大量消耗氧气，并且以大豆中的脂类作为主要能源物质，以供其生长需求。而纳豆菌制剂由于其纳豆菌液体培养产物用脱脂奶粉作为保护剂制成，因此粗脂肪的含量没有显著变化（p>0.05）。

大豆粉经过发酵成为纳豆，总糖含量极显著减少（从24.69 g/100 g减少到10.9 g/100 g）。这是由于在发酵过程中，纳豆菌大量地分解碳水化合物，以满足其新陈代谢的需求。

纳豆菌制剂的水分含量较纳豆菌液体培养产物极显著降低（p<0.01），纳豆冻干粉中水分含量较大豆粉显著降低（p<0.05）。大豆粉的水分含量达到11.27 g/100 g，而纳豆菌制剂和纳豆冻干粉的水分含量明显降低，因此将纳豆菌液体培养产物和纳豆制成冻干粉更加利于保存。

纳豆菌制剂的灰分含量较纳豆菌液体培养产物显著升高（p<0.05），纳豆冻干粉的灰分含量较大豆粉极显著升高（p<0.05），这是由于纳豆冻干粉和纳豆菌制剂都是加入脱脂15%的奶粉作为冻干保护剂，奶粉中含有一定量的无机物，所以纳豆冻干粉和纳豆菌制剂的无机物含量增加。

纳豆菌制剂中氨基酸态氮较纳豆菌液体培养产物显著增加（p<0.05），说明在液体培养的过程中，纳豆菌利用培养基进行发酵产生了氨基酸，使得氨基酸态氮含量显著增加。经过加工，氨基酸态氮含量在纳豆冻干粉中较大豆粉显著增加（p<0.05），且纳豆冻干粉的氨基酸态氮值达到0.76 g/100 g而大豆粉仅为0.28 g/100g，说明氨基酸含量高且纳豆发酵程度高。

纳豆冻干粉的粗纤维含量较大豆粉显著降低（p<0.05），纳豆菌制剂较纳豆菌液体培养产物的粗纤维含量显著降低（p<0.05）。这主要是因为纳豆芽孢杆菌在生长过程中能够产生分解纤维的纳豆激酶，这也是溶栓的主要原因。纤维具有促进人体肠道蠕动，但是过多的粗纤维会影响其它营养素的利用率，因此纳豆中的营养更有利于吸收。

2.4 营养成分分析

在发酵过程中，纳豆菌利用大豆或培养基，不断产生纳豆激酶，因此表2中纳豆及纳豆冻干粉的纳豆激酶活力显著升高。研究表明纳豆激酶具有抗血栓、抗高压的效果，常被作为心血管疾病人的膳食补充剂[11]。纳豆激酶的纤溶能力特强，这与2.3中粗纤维含量的变化趋势相吻合。

表1 基本成分（g/100 g）分析表（±s，n=3）Table 1 Basic nutrient components（g/100 g）analysis results（±s，n=3）

表1 基本成分（g/100 g）分析表（±s，n=3）Table 1 Basic nutrient components（g/100 g）analysis results（±s，n=3）

注：与纳豆菌液体培养产物比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与大豆粉比较，*p＜0.05，**p＜0.01；表2同。

成分 粗蛋白 粗脂肪 总糖 水分 灰分 氨基酸态氮 粗纤维纳豆菌液体培养产物 0.83±0.21 1.65±0.13 2.75±0.41 92.13±2.45 1.93±0.12 0.35±0.02 0.37±0.01奶粉 28.03±0.30 1.17±0.14 57.97±7.06 3.95±0.11 7.63±0.14 0.32±0.06 0.18±0.02纳豆菌制剂 17.4±0.29## 2.63±0.2 61.32±3.48## 8.01±0.16## 9.56±0.16# 0.67±0.04# 0.12±0.06#大豆粉 34.38±1.98 18.56±1.06 24.69±1.76 11.27±0.13 4.73±0.03 0.28±0.02 5.28±0.82纳豆 16.5±2.31* 10.31±1.29* 10.9±0.89* 55.92±3.56** 1.43±0.21* 0.43±0.12 3.97±1.73*纳豆冻干粉 31.7±1.73 13.14±1.34* 26.44±0.09 6.28±0.16* 5.95±0.16* 0.76±0.03* 3.87±0.56*

经过加工，纳豆冻干粉中的大豆异黄酮含量极显著低于大豆粉（p<0.01）。大豆异黄酮由六种主要成分组成，其中染料木素是最稳定的，在加工过程中，纳豆芽孢杆菌将大豆中的其它的大豆异黄酮配基氧化分解，使得大豆异黄酮的含量显著下降，这与研究[12]试验结果类似。大豆是亚洲人口日常饮食的一部分，富含大豆异黄酮（IFs），具有很多的生理特性，如抗肿瘤、抗更年期（女）、骨质疏松和抗衰老[13]。

表2 营养成分分析表（±s，n=3）Table 2 Nutrient components analysis results（±s，n=3）

表2 营养成分分析表（±s，n=3）Table 2 Nutrient components analysis results（±s，n=3）

注：“-”表示未检测出。

成分 纳豆激酶（U/g） 大豆异黄酮（mg/g） 植酸（mg/g） 维生素K2（mg/g）纳豆菌液体培养产物 409.24±10.31** - - -奶粉 0 0.01±0.00 - -纳豆菌制剂 406.72±53.14** 0.003±0.001 0.08±0.02## -大豆粉 - 2.56±0.06 12.74±0.75 4.87±0.26纳豆 98.02±3.52** 1.41±0.56** 7.97±1.01** 4.23±0.21**纳豆冻干粉 96.78±6.66** 1.38±0.12** 7.38±0.84** 3.32±0.05*

表3 冻干粉保藏试验活菌数变化结果Table 3 The viable bacteria changes result of lyophilization powder preservation

在加工过程中，大豆中的植酸含量从12.74 mg/g极显著降低至7.38 mg/g（p<0.01）。植酸主要存在于植物种子，它可以与金属离子形成不可溶的盐[14]，降低Cu、Zn、Mn、Fe和Ca等矿物质在体内的生物活性，具有抗营养特征[15]。研究表明发酵能降低14%的植酸[16]，大豆中植酸含量的降低有助于大豆营养成分的利用，对受体更加有益。

由于维生素在加工过程中会产生分解，纳豆冻干粉中的维生素K2含量较大豆粉降低。纳豆菌在生长繁殖过程中，吞噬大豆蛋白或利用培养基，产生大量的维生素。而维生素K2能够促进血液正常凝固，治疗三高和溶解血栓，产生出氨基酸的美味。另外它还具有强骨[17]，并且对治疗绝经女性的骨质疏松症有很大的帮助[18]。由于维生素K2会使血液凝固阻止剂新香豆素失去药效，因此心脑血管患者不要食用纳豆。

2.5 冻干粉保藏试验

分别对纳豆菌制剂和纳豆冻干粉进行活菌数测定，实验结果见表3。温度对纳豆菌制剂和纳豆冻干粉的活菌数没有显著影响，且活菌数在50 d内不会产生显著变化（p>0.05）。4℃活菌数明显高于15℃，所以在保藏过程中尽量采用4℃。

3 结论

通过基本营养成分分析发现：纳豆菌制剂和纳豆冻干粉水分含量显著降低，且活菌数在短时间内变化不显著，因此利于保存。纳豆菌能够分解粗蛋白、粗脂肪和总糖，维持生长需求。纳豆冻干粉和纳豆菌制剂中的纳豆激酶能够分解粗纤维，具有强烈的纤溶作用和抗血栓的作用，因此给心脑病患者带来福音。植酸与矿质元素形成不溶盐，具有强烈抗营养作用。本试验虽然测定了一些基本的成分含量，但是还是不够全面，在以后的试验中要继续完善。综合试验结果，纳豆冻干粉的营养价值最高。另外纳豆菌对于肠道菌群和免疫都有一定的作用，因此纳豆菌制剂和纳豆冻干粉的制作为后续试验提高了原材料。

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Components compare analysis of bacillus natto preparation and natto lyophilization powder

WU Gao-feng，HUANG Zhan-wang*，LIU Wan-ling，NIU Li-ya，HUANG Yong-ping，WANG Su-zhen
（Institute of Food Science and Engineering of Jiangxi Agricultural University，Key Laboratory of Natural Product and Function Food of Jiangxi，Nanchang 330045，China）

The main nutrients were measured to study the main component of the fermented natto and compare the nutrition components of natto and bacillus natto prepration with the soybean powder，the changes of main components were explored during the fermentation process.The results showed that compared with soybean powder，ash and amino acid nitrogen content in natto lyophilization powder（NLP）were increased significantly（p<0.05）.The crude fiber，crude fat，moisture content in NLP decreased significantly（p<0.05）.Compared with liquid culture product of bacillus natto，the crude protein content in bacillus natto preparation（BNPr）was extremely increased significantly（p<0.01），while the ash and amino acid nitrogen content were increased significantly（p<0.05）.The moisture content was decreased extremely significantly（p<0.01）and the crude fiber content was decreased significantly（p<0.05）.In addition，after fermentation，the natto kinase content in BNPr and NLP increased，and the soybean isoflavone and phytic acid content in NLP were decreased extremely significantly（p<0.01），and vitamin K2content significantly decreased（p<0.05）.The experiment proved that BNPr and NLP had higher nutritional value than soybean powder.

soybeans；natto lyophilization powder；bacillus natto preparation；components analysis

TS201.2

A

1002-0306（2015）22-0121-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.016

2015－03－31

吴高峰（1989-），男，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：w1989gf@126.com。

*通讯作者：黄占旺（1964-），男，大学本科，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：huangzw@163.com。

国家自然科学基金项目（31160337）。