1例鸭场暴发鸭疫里默氏杆菌病的诊断

2015-04-20范忠良四川省宝兴县农业局四川宝兴县65700西南民族大学生命科学与技术学院成都6004

养禽与禽病防治 2015年7期

范忠良费磊李键岳华张斌* （四川省宝兴县农业局四川宝兴县 65700 西南民族大学生命科学与技术学院成都 6004）

鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，RA）属黄杆菌科里默氏菌属，为革兰氏阴性、无运动性、不形成芽孢的小杆菌，多呈单个、成双，丝状或链状排列，瑞氏染色时大部分细菌呈两极着色特性。鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎。多见于1～8周龄的小鸭，尤以2～3周龄雏鸭较易感。在临床上以下痢、共济失调和眼鼻有分泌物为特征，病变见有纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、胸膜炎或干酪性输卵管炎为特征[1-3]。鸭疫里默氏杆菌病是严重危害四川省养鸭业的重要细菌性疾病之一，流行广泛，发病率为5%～90%，病死率达80%，给四川养鸭地区造成了较大的经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床病例

四川省成都市某养殖户送到西南民族大学禽病研究所就诊的疑似鸭疫里默氏菌病病鸭，感染鸭为20日龄，病鸭主要临床表现：精神沉郁，共济失调，头颈震颤，有的一侧跗关节肿大，腿软不愿走动或行动蹒跚，食欲下降；排出淡绿色稀便；眼鼻流出浆液性或黏液性分泌物，眼周围羽毛黏连；鼻孔有浆液，凝结堵塞鼻孔，使患鸭呼吸困难；病鸭消瘦，死前有歪头、抽搐、仰卧作划水状或角弓反张等神经症状[4]。解剖病理变化：纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎以及肝肿、脾肿[5]。

1.1.2 试剂

TSA培养基、麦康凯培养基均为杭州微生物有限公司产品；LB培养液为实验室自制；细菌微量生化鉴定管为杭州微生物试剂有限公司产品；PCR相关试剂为北京TIANGEN公司产品；其他化学试剂由本单位实验室提供。

1.1.3 设备

CO2培养箱（Thermoforma公司，美国）；高速离心机5804（Eppendorf公司，德国）；PCR仪my cyclerTM（Bio-Rad公司，美国）；核酸电泳仪 powerpacuniversalTM（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成像系统VerSaDoc2000（Bio-Rad公司，美国）；核酸蛋白检测仪DU800（Beckman公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养

无菌操作采集病鸭的脑、心血和肝脏病料，分别划线接种至含5%马血清的TSA培养基和麦康凯培养基，置于37℃含5%CO2培养箱培养24～48h，并观察菌落形态。

1.2.2 染色镜检

培养后观察细菌菌落特征，挑取疑似RA菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.3 纯培养和PCR鉴定

挑取单个菌落纯化培养，用LB培养液增菌，分别取来源于脑、心血和肝脏的3个分离株的增菌液各1mL，用核酸蛋白检测仪DU800测OD值。采用酚-氯仿抽提法提取DNA。

采用引物 (上游引物P1:5'-GTATTGAAAGCTCTGGCGG-3′和下游引物P2：5′-TCGCTTAGTCTCTGAACCC-3′），进行PCR扩增，扩增片段长度为654bp。反应体系25μL（10×PCR buffer 2.5μL， 2.5 mmol/L dNTP 0.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，10pmol/μL引物各1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，DNA模板1 μL，灭菌去离子水补足25.0μL）。反应条件为95℃预变性5min；94℃30s、56℃30s、72℃1min，共进行30个循环；72℃8min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳分析。同时设RA参考菌株阳性和无模板对照（NTC）。

1.2.4 生化鉴定

用接种针将待检测的RA在无菌的工作台中接种于生化鉴定管中，置于37℃含5%CO2培养箱培养24～48h，同时对待测菌株进行氧化酶、接触酶测定，观察并记录结果。