胡万发，刘晓蕊，王健

（安徽理工大学1.附属肿瘤医院检验科；2.医学院病原学与免疫学教研室，安徽 淮南232001）

肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，其发生和转归与宿主的细胞免疫功能有关。外周血富含各类免疫活性细胞，主要为T淋巴细胞，可表达IL-2R等多种受体，在抗肿瘤免疫应答中起重要作用[1]。CD25是IL-2R的α 亚单位，亦称膜白细胞介素-2受体（membrane interleukin-2 receptor，m IL-2R），是T细胞活化的重要标志，在介导IL-2发挥生物学效应上起关键作用[2]。为探讨其在肝细胞癌的表达水平，本研究选择59例原发性肝癌患者进行外周血CD25及其mRNA检测。报道如下：

1 对象与方法

1.1 临床资料

2010年1月-2011年5月住院的原发性肝癌患者59例，其中依病理分型，巨块型肝癌14例，结节型肝癌26例，弥漫型肝癌19例。患者男41例，女18例，平均年龄49.7岁，其中有18患者接受CIK（cytokine-induced killer）细胞治疗。另随机选取体检正常人群20例为对照组，男12例，女8例，平均年龄38岁。

1.2 试剂与仪器

乙肝病毒标志物（hepatitis B virus marker，HBVM）HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe、anti-HBc诊断试剂购自上海科华生物工程公司；淋巴细胞分离液（上海生化试剂二厂，批号100111）；生物素-链霉亲和素（biotin-streptavidin，BSA）系统m IL-2R诊断试剂购自上海思创生化电子有限公司；AFP放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所，批号：SI0912022）；Trizol试剂盒（美国Gaithersburg公司）；EXL-808全自动酶标分析仪（美国Bio-Teck公司）；TaKaRa梯度PCR仪TP600（日本TaKaRa公司）；Hema-2000凝胶扫描分析系统（珠海Hema公司）；iCycle荧光实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；MDF-135型CO2培养箱（日本Syno公司）。

1.3 方法

1.3.1 CD25检测 静息态CD25检测：取肝素抗凝血2ml，以等量无Ca2+、Mg2+的Hanks'液稀释后，用淋巴细胞分离液常规分离PBMC，用Hanks'液洗涤3次，用含1640完全培养液调整细胞数至（1～3）×109/L，取上述细胞悬液10μl，分别涂布于印有防酸漆圈的玻片孔内，自然干燥后用新鲜丙酮固定15～20min，干后于每一标本印圈内加抗Tac的单克隆抗体10μl，放入湿盒37℃、5%CO2环境孵育30min，然后用TBS漂洗，稍干后加生物素化羊抗鼠IgG 10μl于各孔中，同法孵育、漂洗，最终加新鲜配制的显色液，待显色明显时用TBS漂洗，终止显色，高倍镜下镜检，细胞膜呈棕色者为阳性，不着色者为阴性，共计数200个细胞，分别计算阳性细胞百分率。诱导态CD25检测：取上述细胞悬液0.5ml，加入最终浓度为200μg/ml植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）的1640完全培养液0.5ml，置37℃、5%CO2环境孵育72 h。取沉淀细胞用1640完全培养液稀释至（1～3）×109/L，同法涂片、孵育、漂洗、镜检，行诱导期m IL-2R检测。

1.3.2 CD25 mRNA检测 取PHA孵育前后患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），以RPMI 1640完全培养液调整细胞数至（1～2）×106/ml。用Trizol试剂抽提总RNA，逆转录成cDNA置-86℃冰箱备检。用SYBR Green I荧光标记法检测PCR产物，总反应体系为25μl，2μl标准品或模板cDNA，模板cDNA以1∶4稀释。CD25 mRNA引物设计参照HIRATA等[3]方法，引物序列：sense（5'→3'）为CAAAGTCCAATGCAG CCAGT，Anti-sense（5'→3'）为TCACCTGTGCATAT GAGCTG，扩增片段长度232 bp。以GAPDH为内参标准，每次检测标准品以10倍梯度稀释6个梯度（106、105、104、103、102和10 copies/ml） 绘制标准曲线。3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物sense（5'→3'）：AGAAGGCTGGGGCTCATTTA，anti-sense（5'→3'）：为AGGGGCCATCCACAGTCTTC，扩增片段长度为258 bp。扩增参数：95℃预变性300 s，95℃ 10 s，65℃10 s，40个循环，最后72℃保温300 s，4℃保存。为克服系统误差，设GAPDH为参照，以lgcDNA/lgGAPDH比值代表其最终mRNA水平。

1.4 CIK细胞制备

参照BONANNO等[4]方法，台盼蓝拒染试验检测CIK细胞活度>95%，流式细胞术检测CIK细胞中CD3+CD8+CD56+含量>80%以确定靶细胞。CIK细胞治疗方法：取新鲜制备CIK细胞，每次以2.0×1010浓度细胞悬液输注100ml，每天1次，连续5 d，其他参照郝一文等[5]方法。

1.5 统计学处理

2 结果

与正常对照相比，肝细胞癌患者外周血单个核细胞PHA诱导前后CD25及其mRNA水平均显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。具体见图1～2。CIK细胞治疗后，静息期和诱导期CD25及其mRNA水平明显升高，差异有统计学意义，见图3～4。

图1 肝癌患者外周血CD25表达

图2 肝癌患者外周血CD25 m RNA表达

图3 肝癌患者CIK细胞治疗前后CD25表达

3 讨论

肝细胞癌是目前公认的恶性肿瘤，其确切的发生机制尚未完全阐明，一般认为与宿主的细胞免疫功能有关。PBMCs是多种免疫活性细胞的集合体，主要是T淋巴细胞，可表达IL-2R，在抗肿瘤免疫反应中起重要作用。

图4 肝癌患者CIK细胞治疗前后CD25mRNA表达

IL-2R是IL-2的特异性受体，包括α、β、γ三个亚单位，分别称为CD25、CD122、CD132，其中以CD25较重要，是T细胞活化的标志，在IL-2发挥生物学效应上起关健作用，其表达水平可反映T细胞的激活过程和机体的免疫状态[6]。本研究结果显示，肝癌患者外周血PHA诱导前后CD25表达水平均较正常对照组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01），提示肝癌患者存在明显的细胞免疫功能低下，T细胞处于抑制状态，不能表达足够的CD25，限制宿主抗肿瘤免疫应答。T细胞表面除表达CD25外，还含有PHA受体。以PHA诱导后，CD25表达水平虽较静息期明显提高，提示患者对PHA刺激仍有相当的反应性，但与正常对照相比表达水平仍较低，差异性仍有统计学意义，提示肝癌患者T细胞对PHA的诱导反应弱，活化的T细胞减少或不足[7]。进一步观察不同病理分型患者外周血CD25表达情况，结果显示巨块型、结节型、弥漫型肝癌患者外周血CD25及其mRNA表达水平类似，差异无统计学意义（P>0.05），提示肝癌患者的细胞免疫功能低下与病理分型无关。

CD25 mRNA是反映编码或调控CD25表达和分泌的新型指标，在活化性T细胞高表达。本研究结果显示肝癌患者PBMCs在静息状态下CD25mRNA水平较低，提示患者外周血中T细胞合成分泌CD25的能力较弱。当PBMCs与PHA共孵育后，CD25mRNA水平显著升高，但与对照组相比仍有较大差异（P<0.05），提示PHA能非特异性刺激T细胞活化增殖，但其活化能力仍较正常者低，这种低活性T细胞限制宿主抗肿瘤免疫应答。近年来，多项研究表明，肝细胞癌与HBV、HCV感染密切相关，HBV不仅对肝细胞具有高度的亲和性，还可侵犯PBMCs、淋巴结、肾脏等，形成肝外感染。当HBV侵入PBMCs，一方面在其中复制增殖[8]，甚至通过整合酶形成cccDNA，与宿主细胞基因整合；另一方面促使T细胞产生并释放大量血清可溶性白细胞介素-2受体（soluble interleukin-receptor，sIL-2R），此与CD25产生竞争抑制，限制CD25的表达[9-10]。进一步观察发现，不同病理类型的肝癌患者PHA诱导前后CD25 mRNA水平相似，差异无统计学意义（P>0.05），提示肝癌患者的CD25 mRNA表达与病理分型无关[11]。

CIK细胞是PBMCs在体外多种细胞因子（如抗-CD3单抗、IL-2、IFN-γ、IL-1α）共同作用下，获得的一群以CD3+CD56+T细胞和CD3+CD8+T细胞为主要效应细胞的异质细胞群，具有高增殖潜能的免疫细胞[12]。肝癌患者采用CIK细胞治疗后，发现外周血静息期和诱导期CD25及其mRNA表达均明显升高，提示由于IL-2等刺激，诱导患者T细胞活化，促进细胞表面表达IL-2R，活化的T细胞通过自分泌和旁分泌效应诱导周边的T细胞活化，形成级联放大效应，从而暂时纠正患者细胞免疫功能低下的表现，患者病情得以控制和缓解[13]。有条件的医院可定期为患者输注CIK细胞，使体内活化的T细胞维持在一个相对稳定的水平，以纠正细胞免疫功能紊乱，改善患者生存质量。

综上所述，肝癌患者细胞免疫功能明显低下，主要表现为外周血CD25及其mRNA水平降低，其降低程度与病理分型无关。PHA可体外诱导患者PBMCs表达CD25。CD25可作为观察患者细胞免疫功能和评估疗效的辅助指标。

[1]KORANGY F,HÖCHST B,MANNSMP,et al.Immune responses in hepatocellular carcinoma[J].Dig Dis,2010,28(1):150-154.

[2]LU ZH,CHEN W,JU CX,et al.CD25 is a novel marker of hepatic bile canaliculus[J].Int J Surg Pathol,2012,20(5):455-461.

[3]HIRATA H,ARIMA M,CHENG G,et al.Production of TARC and MDC by naive T cells in asthmatic patients[J].J Clin Immunol,2003,23(1):34-35.

[4]BONANNO G,IUDICONE P,MARIOTTI A,et al.Thymoglobulin,interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer(CIK)cells in clinical-grade cultures[J].J Transl Med,2010,8:129.

[5]郝一文,和予馨,周文玲.自体外周血单个核细胞制备CIK细胞治疗恶性实体肿瘤应用价值研究[J].中国输血杂志,2011,24(9):746-749.

[6]MALEK TR,CASTRO I.Interleukin-2 receptor signaling:at the interface between tolerance and immunity[J].Immunity,2010,33(2):153-165.

[7]WANG J,JIANG SQ,XIANG GJ.Relationship between expression of HBVx-DNA in peripheral blood of the patients with chronic hepatitis B[J].Chin J Public Health,2006,22(10):1187-1189.

[8]WANG KX,ZHANG LH,PENG JL,et al.Effect of liniment levamisole on cellular immune functions of patients with chronic hepatitis B[J].World J Gastroenterol,2005,11(45):7208-7210.

[9]CABRERA R,ARARAT M,EKSIOGLU EA,et al.Influence of serum and soluble CD25 (sCD25)on regulatory and effector T-cell function in hepatocellular carcinoma[J].Scand J Immunol,2010,72(4):293-301.

[10]WANG J,WANG Y,XIANG GJ.The influence of PBMC infected by HBV on the expression of CD25 mRNA in immune cells of the patients[J].Chin J Microbiol Immunol,2007,27(6):523-524.

[11]OHIRA M,NISHIDA S,TRYPHONOPOULOS P,et al.Clinical-scale isolation of interleukin-2-stimulated liver natural killer cells for treatment of liver transplantation with hepatocellular carcinoma[J].Cell Transplant,2012,21(7):1397-1406.

[12]PAN K,LI YQ,WANG W,et al.The efficacy of cytokine-induced killer cell infusion as an adjuvant therapy for postoperative hepatocellular carcinoma patients[J].Ann Surg Oncol,2013,20(13):4305-4311.

[13]MORISAKI T,ONISHI H,KOYA N,et al.Combinatorial cytotoxicity of gemcitabine and cytokine-activated killer cells in hepatocellular carcinoma via the NKG2D-MICA/B system[J].Anticancer Res,2011,31(7):2505-2510.