马逢乐，刘宝刚，王 娟，何欣遥，王志华，何文喜

（1．军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西西安710032；2．第二炮兵总医院礼士路门诊部，北京100820）

ERK信号通路在人牙髓干细胞增殖与分化中的作用

马逢乐1，刘宝刚2，王 娟1，何欣遥1，王志华1，何文喜1

（1．军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西西安710032；2．第二炮兵总医院礼士路门诊部，北京100820）

目的：探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路是否参与对人牙髓干细胞（hDPSCs）增殖及分化过程的调控。方法：用不同浓度的ERK通路抑制剂U0126干预hDPSCs，用CCK－8法检测细胞增殖；在矿化液诱导条件下，用不同浓度U0126干预hDPSCs 14 d，茜素红染色观察矿化结节的形成，RT－PCR检测成骨／成牙相关基因ALP、OCN、DSPP及BSP的表达；Western blot检测U0126（25μmol／L）干预后，ERK通路活性的变化。结果：不同浓度的U0126对hDPSCs的增殖能力无显著影响（P＞0．05）；与对照组相比，不同浓度的U0126对矿化结节的形成和成骨／成牙相关基因ALP、OCN、DSPP及BSP的表达均有抑制作用，25μmol／L U0126的抑制作用最明显（P＜0．05）；Western blot结果显示随着时间的延长，p－ERK的表达量逐步增加，在加入25μmol／L U0126后，p－ERK表达量下降（P＜0．05）。结论：ERK信号通路可能不参与对hDPSCs增殖的调控，而在促进hDPSCs成骨／成牙分化过程中起调控作用。

人牙髓干细胞（hDPSCs）；ERK信号通路；增殖；分化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：277］

Gronthos等［1］（2000）利用collagenaseⅠ和dispase消化法，成功的从牙髓组织中分离出了间充质干细胞，并提出了牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的概念。研究表明，牙髓干细胞在不同的诱导剂作用下，可以分化为成牙本质细胞、脂肪细胞和神经样细胞等多种细胞［2－3］。碱性磷酸酶（ALP）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）等常被用于鉴定DPSCs分化的特异性指标［4－5］。近年来，DPSCs作为牙齿再生的种子细胞，已成为组织工程应用的重要细胞来源。

研究表明，干细胞的增殖和分化受到多种信号通路的调控，分子机制复杂。Wnt／β－catenin信号通路［6－7］和Notch信号通路［8］在调控神经干细胞增殖、分化中发挥重要作用；NF－κB通路能够调控间充质干细胞［9］和牙周膜干细胞［10］的成骨分化。那么，在DPSCs的增殖和分化过程中有哪些通路参与调控，目前还不清楚。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸和（或）苏氨酸蛋白激酶，在细胞应激和损伤反应中发挥重要作用。目前为止，已发现了 4种不同的MAPK［11］，其中细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase，ERK）是最早被发现的，且被认为与细胞的增殖和分化相关。近年来研究发现，ERK信号通路在调控干细胞增殖、分化过程中发挥重要作用。有研究表明，血管内皮生长因子可以激活MEK／ERK通路和PI3K／Akt通路，从而促进大鼠海马细胞的增殖［12］；还有研究表明，IL－2可以激活ERK通路，促进淋巴B细胞的增殖和向浆细胞的分化［13］；三氧化矿物凝聚体（MTA）能够激活JNK和ERK通路，促进骨髓间充质干细胞的成骨／成牙本质分化［14］；但ERK信号通路是否参与人牙髓干细胞（hDPSCs）的增殖、分化调控，目前研究甚少。本研究通过观察ERK通路抑制剂U0126对hDPSCs的增殖和成骨／成牙分化的影响，从而探讨ERK信号通路在hDPSCs增殖和分化中的作用。

1 材料和方法

1．1 主要材料、试剂和仪器

二氧化碳细胞培养箱（Thermo，美国）；超净工作台（上海净化设备有限公司）；倒置相差显微镜和照相系统（Olympus，日本）；Real time PCR仪（ABIPrism 7500，美国）；电泳仪（BIO－RAD，美国）；红外成像仪（Odyssey，美国）；α－MEM、Ⅰ型胶原酶、Dispase酶、胰蛋白酶（Gibco，美国）；胎牛血清（HyClone，美国）；β－甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C、茜素红（Sigma，美国）；U0126（Invivo Gen，美国）；CCK－8（南京恩晶生物）；RIPA裂解液、5×SDSPAGE Loading Buffer、β－actin单克隆抗体（北京康为世纪）；ERK单克隆抗体、p－ERK单克隆抗体（CST，美国）；PVDF膜（Millipore，美国）；细胞总RNA提取试剂盒（Omega，美国）；反转录试剂盒、Real Time－PCR试剂盒（Takara，日本）；Tris、甘氨酸、吐温－20（MP，美国）；BSA（Thermo，美国）；氯化钠、甲醇（国产分析纯）。

1．2 ERK通路抑制剂U0126在hDPSCs成骨／成牙分化过程中的作用

1．2．1 实验分组及矿化诱导

取3代hDPSCs，当细胞长至80%～90%融合时，在矿化液 （2．16 g／Lβ－甘油磷酸钠 、0．05 g／L维生素C、0．785 g／L地塞米松）的条件下，分别加入5、10、25μmol／L的U0126作为实验组，以含100 mL／L胎牛血清的α－MEM作为空白组，以单纯矿化液诱导为对照组，进行后续实验。

1．2．2 CCK－8细胞增殖情况

取3代hDPSCs，当细胞长至约80%～90%融合时，消化离心后收集细胞，以每孔2 000个细胞接种至96孔板，每孔100μL，用不含胎牛血清的α－MEM饥饿24 h，分别加入5、10、25μmol／L的U0126，用含100mL／L胎牛血清的α－MEM作为对照，每组设置5个副孔，分别刺激1、3、5、7 d，每孔加入10μL CCK－8，37℃孵育4 h后酶标仪检测562 nm波长下的吸光值。

1．2．3 茜素红染色

取3代hDPSCs，当细胞长至80%～90%融合时，矿化诱导14 d，弃去诱导液用PBS漂洗3次，40 g／L多聚甲醛固定20 min，去离子水漂洗3次，茜素红染色10 min后肉眼及倒置显微镜下观察矿化结节的形成。

1．2．4 RT－PCR检测

取3代hDPSCs，当细胞长至80%～90%融合时，矿化诱导14 d，弃去诱导液用PBS漂洗3次，用RNA提取试剂盒提取mRNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA，以GAPDH（人磷酸甘油醛脱氢酶）作为内参基因，并以GENE BANK数据库设计骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨唾液蛋白（BSP）、GAPDH基因的引物（具体引物序列见表1），由上海生工生物合成。按说明书进行Real－Time PCR，每组3个副孔并重复试验3次。

表1 实时定量PCR作用引物名称及序列

1．3 ERK通路抑制剂U0126调控hDPSCs成骨／成牙分化的分子机制

1．3．1 实验分组及矿化诱导

取3代hDPSCs，当细胞长至80%～90%融合时，分别进行矿化诱导，分组为矿化诱导5、15、30、60 min，矿化诱导＋25μmol／L U0126，以含100 mL／L胎牛血清的α－MEM作为对照组。

1．3．2 Western Blot检测

上述细胞弃去诱导液用PBS漂洗3次；加入150μL RIPA裂解液裂解细胞，4℃12 000 r／min离心15 min，取上清；加入5×SDS PAGE Loadling Buffer沸水浴10 min后，80 V、30 min，120 V、1 h进行PAGE电泳；电泳结束后2 h、200 mA冰浴转膜；转膜完毕后用50 g／L的BSA室温封闭2 h；一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次15 min；二抗室温孵育2 h，TBST漂洗3次，每次15 min；用红外成像仪进行结果分析。

1．4 统计学分析

采用SPSS 17．0统计软件进行统计分析，两两比较用t检验，检验水准α＝0．05。

2 结果

2．1 ERK信号通路抑制剂U0126对hDPSCs增殖的影响

取3代hDPSCs，CCK－8法检测其1、3、5、7 d细胞增殖情况，结果显示：与对照组比较，5、10、25μmol／L U0126组细胞增殖均无明显差异（P＞0．05）（图1）。

图1 CCK－8细胞增殖情况

2．2 ERK信号通路抑制剂U0126对hDPSCs成骨／成牙分化的影响

2．2．1 茜素红染色结果

取3代hDPSCs，矿化诱导14 d后，茜素红染色结果显示，对照组矿化结节明显多于空白组，而与对照组相比，实验组矿化结节明显减少，25μmol／L U0126组减少最明显，而5μmol／L U0126与10μmol／L U0126组间无显著差异（图2），定量结果与肉眼观察结果一致（图3）。

2．2．2 RT－PCR检测结果

取3代hDPSCs，矿化诱导14 d后，RT－PCR检测成骨／成牙相关基因ALP、OCN、DSPP和BSP的表达情况，结果显示与空白组相比，对照组ALP、OCN、DSPP和BSP的表达均明显上调，而除5μmol／L U0126组ALP的表达与对照组无显著差异（P＞0．05），10μmol／L U0126与25μmol／L U0126组ALP、OCN、DSPP和BSP的表达和对照组相比均明显下调，且以25μmol／L U0126组下调最明显（P＜0．05）（图4）。

2．3 ERK通路抑制剂U0126调控hDPSCs成骨／成牙分化的分子机制

取3代hDPSCs，短时间矿化诱导并加入ERK信号通路抑制剂U0126（25μmol／L）后，Western blot检测ERK、p－ERK蛋白表达结果显示，随着时间的延长，p－ERK的表达量明显增加，并在加入抑制剂U0126后，表达量显著下降（图5）。

图2 各组茜素红染色情况

图3 茜素红染色定量结果

图4 成骨／成牙相关基因的表达水平比较

图5 ERK信号通路的蛋白表达和p－ERK相对表达量

3 讨论

大量研究表明，在干细胞增殖分化过程中有多种信号途径参与调控。而ERK信号途径作为最早发现的MAPK信号通路中的一条在调控干细胞的增殖分化中发挥重要作用。本研究通过CCK－8、茜素红染色、RT－PCR研究ERK信号通路抑制剂U0126对hDPSCs增殖、分化的影响，并进一步通过Western blot来验证ERK信号通路在hDPSCs分化过程中的激活情况。

有文献表明，同型半胱氨酸能够通过下调p－ERK的蛋白表达量来抑制神经干细胞NSCs的增殖［15］；还有研究表明，上皮调节蛋白EREG能够增加牙乳头干细胞SCAPs中ERK1／2、MEK和JNK的磷酸化水平，从而促进SCAPs的增殖［16］；多肽物质IKVAV可以通过促进磷酸化的MAPK／ERK和磷酸化的PI3K／Akt水平增高，来促进骨髓间充质干细胞BMMSCs的增殖，且呈浓度和时间依赖性［17］；本结果显示与对照组相比，1、3、5、7 d不同浓度U0126刺激组的hDPSCs细胞增殖均无明显变化（P＞0．05），表明ERK信号通路可能不参与对hDPSCs增殖的调控，这与文献报道有所差别，可能与组织来源，细胞种类，所处微环境及时间等综合因素的不同有关。

矿化结节是反应干细胞成骨／成牙分化的重要指标之一。本研究茜素红染色结果显示，与对照组相比，实验组矿化结节明显减少，25μmol／L U0126组减少最明显，而5μmol／L U0126与10μmol／L U0126组组间无显著差异，说明ERK通路抑制剂U0126能够抑制hDPSCs的成骨／成牙分化。

ALP、OCN、DSPP、BSP、CollagenⅠ、DMPs等是成牙本质细胞分泌的细胞外基质蛋白，与牙髓干细胞的成骨／成牙分化密切相关，故本研究选取ALP、OCN、DSPP和BSP作为研究对象。成骨诱导14 d后，RT－PCR检测结果显示，与空白组相比，经矿化诱导后，对照组的ALP、OCN、DSPP和BSPmRNA表达量均明显上调（P＜0．05），而在加入不同浓度的ERK信号通路抑制剂U0126后，除5μmol／L U0126组ALP的表达与对照组无显著差异（P＞0．05）外，10μmol／L U0126与25μmol／L U0126组ALP、OCN、DSPP和BSP的表达和对照组相比均明显下调，且以25μmol／L U0126组下调最明显（P＜0．05），这与茜素红染色结果趋势基本一致，说明ERK通路抑制剂U0126能够抑制hDPSCs的成骨／成牙分化。5μmol／L U0126组ALP的表达与对照组无显著差异，可能是因为ALP为早期的成骨分化指标，经14 d长时间矿化诱导后表达变化可能不明显，也可能与5μmol／L的浓度较低，抑制剂效果不明显有关。

为了进一步验证ERK信号通路在hDPSCs成骨／成牙分化中的作用，我们通过Western blot检测p－ERK的蛋白表达量。结果显示，随着时间的延长，p－ERK蛋白表达量逐渐增加，在加入25μmol／L U0126后，表达量明显下降（P＜0．05），进一步说明了ERK信号通路参与调控hDPSCs的成骨／成牙分化。有文献报道，醋酸氯地孕酮（CMA）能够激活ERK信号通路，促进骨髓间充质干细胞BMMSCs向成骨细胞分化且出现钙沉积，而抑制BMMSCs的成脂分化［18］；在胚胎干细胞中，成纤维生长因子7能够激活ERK／RUNX2信号通路来促进成骨分化［19］；这些与本研究中ERK信号通路可能参与调控促进hDPSCs的成骨／成牙分化的结果相一致。然而，Suzuki等［20］研究发现，ERK途径对小鼠胚胎成骨细胞MC3T3－E1的增殖起重要作用，对其分化作用不明显；廖清船等［21］发现，阻断ERK通路后，对已分化的成骨细胞ALP活性，钙沉积量无抑制作用，表明ERK可能只参与了该细胞的增殖调节；孔维霞［22］等采用骨片法培养C57／BL小鼠骨实质来源的MSCs，取第4代MSCs进行成骨诱导，发现ERK通路可能在早期有负调控作用；这些与本结果相反，可能是由于细胞种属来源不同和抑制剂作用浓度不同造成的。本结果表明ERK信号通路可能在hDPSCs的成骨／成牙分化过程中起调控作用，而不参与对其增殖的调控。那么，是否有其他信号通路参与，它们是如何相互作用进行调控的，还需进一步研究讨论。

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The effect of ERK signaling pathway on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells

MA Feng－le*，LIU Bao－gang，WANG Juan，HE Xin－yao，WANG Zhi－hua，HEWen－xi
（*State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To investigate the function of ERK signaling pathway in the regulation of proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells（hDPSCs）．METHODS：hDPSCs were treated with different concentrations of the ERK signaling pathway inhibitor U0126，and the proliferation wasmeasured by CCK－8 method．The mRNA expression of ALP，OCN，DSPP and BSPwas determined by RT－PCR．Alizarin red stainingwas used to detect themineralized nodules．ERK signaling pathway activation was analyzed by Western blot．RESULTS：ERK inhibitor U0126 had no significant influence on the proliferation ofhDPSCs．U0126 inhibited osteogenic differentiation and dentinogenic differentiation as observed by Alizarin red staining．U0126，especially at25μmol／L，down－regulated the expression of ALP，OCN，DSPPand BSP．U0126 at25μmol／L significantly inhibited ERK signaling pathway activation．CONCLUSION：ERK signaling pathway is probably not involved in the proliferation of hDPSCs，but plays an important role in the osteogenic and dentinogenic differentiation of hDPSCs．

human dental pulp stem cells（hDPSCs）；ERK signaling pathway；proliferation；differentiation

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0277－06

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．004

2014－12－19；

：2015－03－30

国家自然科学基金资助（81271125，81470733）

马逢乐（1989－），女，回族，陕西人。硕士生（导师：何文喜）

何文喜，E－mail：hewenxi＠fmmu．edu．cn