牦牛KAP3.3基因的克隆及生物信息学分析

2015-04-18王宏博梁春年包鹏甲张良斌裴杰吴晓云赵娟花阎萍中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃兰州730050甘肃省牦牛繁育工程重点实验室甘肃兰州730050

中国畜牧杂志 2015年19期

王宏博，梁春年，包鹏甲，张良斌，裴杰，吴晓云，赵娟花，阎萍（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州730050；2.甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，甘肃兰州730050）

王宏博，梁春年，包鹏甲，张良斌，裴杰，吴晓云，赵娟花，阎萍*
（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州730050；2.甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，甘肃兰州730050）

本研究以牦牛的角蛋白关联蛋白3.3（KAP3.3）基因作为研究对象，通过查询GenBank中收录的黄牛KAP3.3基因的mRNA序列设计1对特异性引物，通过逆PCR、PCR以及基因克隆测序的方法首次获得牦牛的KAP3.3基因完整的CDS区序列，并对其进行生物信息学分析。结果表明：牦牛KAP3.3基因的CDS区为297 bp，编码98个氨基酸；编码的蛋白质属于亲水性蛋白。二级结构含有延伸链、β转角以及无规卷曲3种。氨基酸序列与黄牛的完全一致，具有Keratin，high sulphur matrix protein家族的完整结构域。

牦牛；KAP3.3蛋白；CDS区

角蛋白关联蛋白（keratin associated protein，KAP）作为绒毛的重要蛋白，是毛基质的主要成分，与角蛋白中间丝（keratin intermediate filament，KIF）共同构成了毛纤维［1］，在毛干的韧性和强度方面具有重要作用。KAP家族基因在决定绒毛的细度、长度、强度、弯曲、光泽度、弹性等起了关键作用［2］。KAP6、KAP7和KAP8与羊毛的直径相关［3］。而KAP1.1和KAP1.3有一个多态性位点与羊毛的细度有显著相关性［4］。研究发现，KAP3.2基因与毛长和产绒量有一点相关性［5］。而獭兔KAP3.2基因与其毛密度有关［6］。KAP家族基因的研究报道相对较多，但是关于KAP3.3基因的相关报道却在国内外都未发现。且研究KAP家族基因的对象多是绵羊、山羊、人和小鼠，牦牛方面该基因家族的研究尚未见报道。

牦牛主要分布在青藏高原及其周边，能够适应严寒等恶劣环境。牦牛是唯一产绒的牛种，天祝白牦牛是我国稀有珍贵品种，因其全身被白色绒毛而有“祁连白牡丹”等美称。因天祝白牦牛白色绒毛有利于染色，可在多种商品中使用，具有较高的经济价值，研究其绒毛的生长特性对于提高牦牛的产绒量有至关重要的作用。本实验通过克隆得到天祝白牦牛KAP3.3基因CDS区全长序列，并对其蛋白理化性质、亚细胞定位、结构域及功能预测、系统进化等进行分析，为进一步研究该蛋白生理功能及周期表达差异做铺垫。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品、克隆载体及感受态细胞实验样品取自甘肃省天祝藏族自治县，采集天祝白牦牛皮肤组织液氮冻存带回实验室，保存在-80℃冰箱中备用；大肠杆菌（E.coil）由大连宝生物公司提供；克隆载体pGEM-T Easy采自普洛麦格生物技术有限公司。

1.1.2 分子生物学试剂RNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒采自TIANGEN公司；反转录试剂盒由TaKaRa公司提供；琼脂糖由上海YITO公司提供；琼脂粉、酵母浸出粉和胰蛋白胨采自OXOID公司，X-gal、IPTG、Amp采自上海生工生物公司。

1.1.3 引物设计及合成以GenBank中黄牛KAP3.3基因的mRNA序列（登录号：XM_002702188.3）为模板，使用Primer Primer5.0设计1对引物，序列为F：5′-AAGCCACTGATGACACCTCA-3′，R：5′-GAGCCACA GTTAGTTGCAGG-3′，委托上海生工生物公司进行合成。

1.2 实验方法

1.2.1 提取皮肤样品中的总RNA于10月中旬选取1只成年的体质健康的雄性天祝白牦牛，将体侧部位绒和毛剪去，用刀片切割皮肤组织，使用RNA提取试剂盒提取牦牛皮肤组织RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将浓度稀释至500 ng/μL，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR按照TaKaRa公司反转录试剂盒的要求进行反转录反应，合成牦牛皮肤组织的cDNA。主要步骤为在PCR管依次加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNase Free dH2O 6 μL，500 ng/μL总RNA 1 μL，混匀后42℃2 min。在以上反应中依次加入5×Prime Script Buffer 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，RT PrimerMix 1 μL，Prime－Script RT Enzyme Mix 1 μL，混合后42℃15 min，85℃5 s条件下反应，得到cDNA，采用NanoDrop2000/2000c分光光度计检测浓度后，放入-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增根据设计的引物，以cDNA为模板，使用2×Taq PCR MasterMix进行扩增。反应体系50 μL：模板2 μL，10 mmol/L引物F、R各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，ddH2O 20 μL。PCR反应体系：预变性94℃4 min；变性94℃30 s，退火62.8℃30 s，延伸72℃50 s，循环30次；72℃10 min。使用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，根据琼脂糖凝胶回收试剂盒的操作步骤将PCR产物回收并取6 μL加入1%琼脂糖凝胶进行检测。

1.2.4 克隆KAP3.3基因将检测合格的PCR产物加入含有pGEM-T Easy克隆载体的液体中，并加入T4 DNA连接酶以及Buffer，在16℃水浴锅中进行过夜连接。将过夜连接的质粒加入到E.coil DH5α感受态细胞中并加入SOC培养基，在恒温摇床37℃，200 r/min振荡培养1 h，取适量涂布于含有X-gal、IPTG和Amp抗性的LB固体培养基上，在恒温培养箱37℃培养12 h。使用接种环挑取培养基上白色阳性光滑菌落，并将其接种于含有Amp的LB液体培养基中，在37℃恒温培养箱中200 r/min进行过夜培养。依照质粒回收试剂盒的说明对菌液中的质粒进行提取，进行双酶切鉴定。将鉴定合格的菌液委托上海生工生物公司进行序列测定。

1.2.5 KAP3.3基因的生物信息学分析使用在线软件Open Reading Frame Finder（ORF Finder）（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）预测牦牛KAP3.3基因的开放阅读框；将牦牛KAP3.3基因编码蛋白的氨基酸序列输入到在线软件ProtScale（http：//web. expasy.org/protscale/）和Protparam（http：//web.expasy. org/protparam/）进行蛋白质的疏水性质和理化性质分析；使用PSORT II（http：//psort.nibb.ac.jp/）在线软件预测亚细胞定位；使用在线软件NetPhos2.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/）、TMHMM ServerV2.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和SignalP4.1（http：//www.cbs. dtu.dk/services/SignalP-4.1/）分析蛋白质的磷酸化位点、跨膜结构域及信号肽位点；使用FoldIndex（http：//bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex）在线软件分析氨基酸序列的无序化特性；使用在线软件Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）分析蛋白质的结构域；使用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma. html）在线软件预测蛋白质的二级结构。使用ProtFun 2.2（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）在线软件进行蛋白质功能预测。在GenBank中下载不同物种KAP3.3基因编码的氨基酸序列，使用MegAlign软件进行同源性分析；使用MEGA 5.1软件进行NJ法构建KAP3.3基因的系统发育树。

2 结果

2.1 牦牛KAP3.3基因PCR扩增将扩增产物加入到1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，结果显示PCR产物的条带与Marker的700 bp基本一致，该片段与696 bp的目的片段大小相符（图1）。

图1 牦牛KAP3.3基因的PCR电泳图

2.2 牦牛KAP3.3基因的克隆及序列分析将克隆测序的结果去除载体序列结果与预期一致，为696 bp。BLAST分析显示，与黄牛的相似度高达99%，可以确定该基因是牦牛KAP3.3基因。ORF Finder在线分析发现牦牛KAP3.3基因的开放阅读框为297 bp，共编码98个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA（图2）。

图2 牦牛KAP3.3基因开放阅读框及编码蛋白序列

2.3 牦牛KAP3.3蛋白的生物信息学分析

2.3.1 理化性质分析使用Protparam在线软件对牦牛KAP3.3蛋白的理化性质进行分析发现，牦牛KAP3.3蛋白的分子量为10.4162 ku，PI值为5.37，该蛋白包含20种基本氨基酸，含量最高的为Cys（19.4%），含量最低的为Lys（1%）、Trp（1%）、Met（1%）和Tyr（1%）。带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）有5个，带正电荷的氨基酸（Arg+Lys）有3个。

2.3.2 亲疏水性和跨膜结构分析根据ProtScale在线软件分析牦牛KAP3.3基因氨基酸序列的亲疏水性。由图3可知，KAP3.3氨基酸序列第5位峰值最高，为1.967；第88位峰值最低为-1.244，平均峰值为-0.49，属于亲水蛋白质。蛋白跨膜区域预测发现牦牛KAP3.3蛋白全部氨基酸都在膜的表面，从而证实该蛋白是一种表面蛋白。

图3 牛KAP3.3蛋白亲疏水性分析结果

2.3.3 亚细胞定位分析在线软件PSORT II对牦牛KAP3.3蛋白亚细胞进行定位分析。由表1可知，其分布在线粒体的可能性为21.7%，分布在细胞核的可能性为34.8%，胞外分泌的可能性为17.4%，分布在细胞质的可能性为21.7%，分布在细胞骨架上的可能性为4.3%。因此可以判断该蛋白主要在细胞核内发挥生物学作用。

表1 牦牛KAP3.3蛋白亚细胞定位%

2.3.4 磷酸化和信号肽位点分析依照NetPhos2.0 Server软件预测牦牛KAP3.3基因编码蛋白质磷酸化位点可知（图4），KAP3.3蛋白共有5个磷酸化位点，分别是Ser 3个、Thr 2个。使用SignalP4.1预测KAP3.3蛋白的切割位点以及分泌途径可知该蛋白没有信号肽。

2.3.5 无序化特性及结构域分析根据FoldIndex软件分析牦牛KAP3.3蛋白氨基酸序列的无序化特性，可知KAP3.3蛋白中并未发现无序化区域。根据软件Interpro对牦牛KAP3.3蛋白进行结构域预测（图5），可知该序列有完整的Keratin，high sulphur matrix protein家族蛋白的结构域。

2.3.6 二级结构预测使用软件SOPMA预测KAP3.3蛋白的二级结构（图6），可知该蛋白延伸链含26个氨基酸，占26.53%；β转角含3个氨基酸，占3.06%；无规卷曲含69个氨基酸，占70.41%。

2.3.7 功能预测在线软件ProtFun2.2预测的结果（表2）可知，KAP3.3是结合转运蛋白，并且都是具有酶功能的蛋白，蛋白加粗的表示功能的指向。

2.3.8 系统进化分析从NCBI数据库中下载以下KAP3.3蛋白的序列：抹香鲸（Physetermacrocephalus）（XM_007129082.1）、黄牛（Bostaurus）（NM_001077103.1）、小须鲸（Balaenoptera acutorostrata）（XM_007177606.1）、人（Homo sapiens）（BC093845.1）、羊驼（V.pacos）（XM_006214297.1）、埃式象鼩（E.edwardii）（XM_006889436.1）、大熊猫（Ailuropoda melanoleuca（David））（XM_002924947.1）。根据MegAlign软件进行同源性比较分析。图7显示，牦牛KAP3.3蛋白跟黄牛的完全一致，相似性为100%。使用MEGA5.10软件进行NJ法构建系统发育树（图8），结果与同源性分析比较的结果基本一致，牦牛KAP3.3蛋白与黄牛在同一分支上。

3 讨论

绒毛作为畜牧业重要的副产品，为纺织工业提供重要的天然纤维原料，KAP基因家族是编码绒毛纤维的重要结构蛋白。本实验首次克隆了牦牛KAP3.3基因完整CDS区，并提交到GenBank（登录号：KM514664）。生物信息学分析结果显示，KAP3.3基因开放阅读框长度为297 bp，编码98个氨基酸。编码蛋白分子量为10.416 2 ku，PI值5.37，为亲水性表面蛋白，亚细胞定位结果显示该蛋白主要在细胞核内发挥生物学功能。磷酸化过程是蛋白质翻译后的一个重要过程，与许多生物学功能有关，如DNA损伤修复［1］、转录调节［7］、信号转导［8］、细胞凋亡的调节等［9-12］，牦牛KAP3.3蛋白具有5个磷酸化位点。KAP3.3蛋白没有无序化区域，而在分析该蛋白的结构域时发现其含有完整的Keratin，high sulphur matrix protein家族蛋白的结构域。含有延伸链、β转角、无规卷曲3种二级结构，无规则卷曲含量最高，占70.41%，β转角含量最少，只占3.06%。这3种元件共同决定KAP3.3蛋白的高级结构，使其具有生物学功能。

图4 牦牛KAP3.3蛋白磷酸化位点预测

图5 牦牛KAP3.3蛋白结构域预测

图6 牦牛KAP3.3蛋白的二级结构预测

表2 牦牛KAP3.3蛋白的功能预测

牦牛和黄牛KAP3.3蛋白的系统进化分析发现其保守性达100%，但编码基因BLAST分析结果显示其相似度为仅99%，说明编码部分蛋白的碱基发生了同义突变。对高原型藏绵羊KAP3.2的研究发现该基因处于Hardy-Weinberg非平衡状态，且等位基因数明显偏低，处于中度多态，推测是由长期迁徙、遗传漂变及本品种选育过程中产毛性状受高强度人工选择导致其高度近交，造成部分等位基因流失有关［13］。系统进化分析发现，牦牛和黄牛的KAP3.3蛋白处于同一个分支，说明牦牛和黄牛的KAP3.3亲缘性较近。来自父系遗传［14］、母系遗传［15］及常染色体的研究都显示牦牛与黄牛的遗传距离较近，与本研究结果一致。8个物种的蛋白相似率达到了80%以上。说明KAP3.3蛋白比较保守，吴添文［5］通过比较家兔KAP3.3基因序列与小鼠、猪、人、黑猩猩、牛等哺乳动物的同源性，发现均达80%以上，指出该基因在不同物种中存在着一定差异，但也说明该基因在进化过程中相对保守，其结果与本研究一致。

图7 不同物种KAP3.3蛋白相似性分析

图8 NJ法构建KAP3.3蛋白的系统发育树

4 结论

牦牛KAP3.3基因CDS区的全长为297 bp，共编码98个氨基酸，该蛋白是亲水蛋白，主要在细胞核内发挥生物学作用，含有5个磷酸化位点，有3种二级结构，含有完整的Keratin，high sulphur matrix protein家族结构域，是一个保守性较高的蛋白。

［1］张桂山，薛景龙，孙俪敏，等.不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1基因差异表达研究［J］.中国畜牧兽医，2014，41（5）：76-79.

［2］赵志东.KAP9.2基因的群体遗传变异及羊绒生长期和休止期基因的表达研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2012.

［3］Parsons Y，Cooper D，Piper L.Evidence of linkage between highlycineyrosine keratin gene loci and wool fibre diameter in a Merino halfib family［J］.Anim Genet，1994，25（2）：105-108.

［4］刘桂芬，田可川，张恩平，等.优质细毛羊羊毛细度的候选基因分析［J］.遗传，2007，29（1）：70-74.

［5］吴添文.家兔毛囊发育规律及其相关基因的遗传效应、表达规律研究［D］.扬州：扬州大学，2011.

［6］宦霞娟，陈玉林.獭兔KAP和FGF5基因的多态性与经济性状的关系［J］.西北农业学报，2009，18（6）：12-17.

［7］贾桦，杨丽娟，李爱华，等.宁夏滩羊KAP1.1基因多态性及其与二毛裘皮重要性状关系的研究［J］.牡丹江医学院学报，2013，34（6）：1-5.

［8］刘一飞，范瑞文，董常生.羊驼皮肤KAP3.2基因3'端序列的cDNA克隆及序列分析［J］.山西农业科学，2010，38（7）：108-111.

［9］邓新宇，姜颖，贺福初.磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展［J］.遗传，2007，29（10）：1163-1166.

［10］Kobor M S，Greenblatt J.Regulation of transcription elongation by phosphorylation［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1577（2）：261-75.

［11］Ohkura H.Phosphorylation：polo kinase joins an elite club［J］. Curr Biol，2003，13（23）：R912-R914.

［12］Ruvolo P P，Deng X，May W S.Phosphorylation of Bcl2 and regulation of apoptosis［J］.Leukemia，2001，15（4）：515-522.

［13］王志有，祁全青，陈玉林.高原型藏绵羊KAP基因单核苷酸多态性分析［J］.中国畜牧兽医，2010，37（10）：120-124.

［14］蔡欣，赵芳芳，孙磊.牦牛与其他家牛属动物SRY基因多态性及其父系进化关系分析［J］.中国畜牧兽医，2014，41（5）：190-195.

［15］李齐发，李隐侠，赵兴波，等.牦牛线粒体DNA细胞色素b基因序列测定及其起源、分类地位研究［J］.畜牧兽医学报，2006，37（11）：1118-1123.