张向前，董新龙，李虹，凌姣姣，张跟喜，王金玉（扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州 225009）

不同鸡品种IGF-I基因5′调控区TrulⅠ位点的多态性分析

张向前，董新龙，李虹，凌姣姣，张跟喜*，王金玉
（扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州 225009）

胰岛素样生长因子-I是调节动物生命活动重要的多肽生长因子之一，它对动物的生长发育及代谢有重要的调控作用。本研究根据GenBank中发表的鸡胰岛素样生长因子I基因（IGF-I）的序列针对5′调控区的TrulⅠ位点设计1对引物。采用PCR-RFLP技术检测边鸡、京海黄鸡、尤溪麻鸡和AA鸡TrulⅠ位点的多态性，并试图探索Trul I位点的多态性和边鸡经济性状的关系。结果表明：边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡TrulⅠ位点存在多态性，而AA鸡不存在多态性；在京海黄鸡和尤溪麻鸡中形成AA、AB和BB 3种基因型，在边鸡中仅存在AA和AB基因型，基因型分布在4个鸡品种中并不一致。该位点能否作为边鸡经济性状的一个遗传标记有待进一步研究。

胰岛素样生长因子I基因；鸡；PCR-RFLP；多态性

胰岛素样生长因子-1是调节动物生命活动重要的多肽生长因子之一，它对动物的生长发育及代谢有重要的调控作用。鸡IGF-I基因全长约50 kb，包括4个外显子和3个内含子［1］。近年来随着IGFI基因在家禽中的研究不断深入，已确定IGF-1基因在禽类胚胎期和出生后的生长过程中起重要作用［2］。Gouda等［3］研究了IGF-I基因的多态性对埃及鸡品种生长性状的影响。Promwatee等［4］研究了IGF-I基因的多态性与4个泰国鸡品种生长和屠宰性能的相关性，发现IGF-I对4个鸡品种的初生重，4、8、12、14周龄重以及0～14周龄的日增重均有显著影响。万秋蓓等［5］进行了IGF-I基因5′调控区Pst I位点的多态性与繁殖性状关系的研究，发现新扬州鸡中，BB型在产蛋性能上表现出了强烈的优势。研究已证明，IGF-I基因多态性与鸡的生长性状、繁殖性状以及屠宰性状存在关系。

关于鸡IGF-I基因的5′调控区国内外学者做了很多研究。Li等［6］、王宝维等［7］采用PCR-RFLP技术运用PstⅠ酶针对鸡IGF-I基因5′调控区的同一位点进行了研究，测序结果表明，PstⅠ识别位点发生了C→T突变。Amills等［8］、Zhou等［9］采用PCR-RFLP技术运用HinfⅠ酶针对鸡的IGF-I基因的5′调控区的另一酶切位点进行了研究，测序结果表明，HinfⅠ识别位点发生了A→C突变。王强等［10］运用PCR-SSCP技术在鸡的IGF-I基因的5′非翻译区发现一个G的插入。Nagaraja等［11］在IGF-I基因5′非翻译区发现Pst I位点。刘大林等［12］也通过PCR-SSCP技术在京海黄鸡5′非翻译区发现2个A的插入。

5′调控区的很多位点都已被发现，并都做了深入的研究。鸡IGF-I基因5′调控区Trul I位点由王慧华等［13］发现，目前关于Trul I位点的研究极少。本研究采用PCR-RFLP技术，以边鸡、京海黄鸡、尤溪麻鸡和AA鸡为研究对象，研究IGF-I基因5′调控区TrulⅠ位点的多态性，并试图以边鸡为研究对象进一步探索Trul I位点和边鸡经济性状的关系，为4个鸡品种的保种和标记辅助选择提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料300只七世代边鸡母鸡血样采自山西省农科院畜牧兽医研究所；84只京海黄鸡和32只AA鸡血样采自江苏京海禽业集团有限公司；30只尤溪麻鸡血样采自中国农业科学院家禽科学研究所国家地方禽种遗传资源基因库。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取翅静脉采集血样1.5 mL，肝素钠抗凝，置冰盒带回实验室，-20℃保存。常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，对基因组DNA进行OD值测定，并计算其浓度后备用。

1.2.2 引物设计和PCR扩增根据GenBank中的鸡IGF-Ⅰ基因序列（GenBank登录号为EF488284）针对5′调控区TrulⅠ位点设计1对引物，扩增产物大小为157 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：F：5′-AATATGAGCAGCACGGTTGA-3′；R：5′-TTTTCC AAACAGTGATGGTAGC-3′。PCR反应完成后，用10%的聚丙烯酰胺凝胶检测扩增结果。

1.2.3 PCR-RFLP检测PCR产物用TrulⅠ酶切，以检测多态性。酶切反应总体积为20 μL，超纯水16.5 μL，Bbv I酶（10 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 2 μL，37℃酶切2 h，酶切产物用交联度为（Acr：Bis）29∶1的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，200 V电泳5 h，硝酸银染色。

1.3 统计分析

1.3.1 哈代-温伯格平衡检验用卡方检验公式，公式如下：

其中，Ei为理论值，Oi为实际观察值，n为等位基因数。1.3.2卡方独立性检验用SPSS11.0的Crosstabs程序进行。

2 结 果

2.1 PCR扩增结果PCR扩增显示所设计的引物扩增效果好，片段长度和预期一致，没有非特异性扩增产物，可以进行PCR-RFLP检测（图1）。

图1 IGF-I基因TrulⅠ位点的PCR产物

2.2 PCR-RFLP检测及测序结果用TrulⅠ酶消化引物的扩增产物，显示3种基因型，分别命名为AA、AB和BB型（图2）。当扩增产物的43 bp处为A时，TrulⅠ酶切产生121 bp和36 bp的片段；当43 bp处为G时，无TrulⅠ酶切位点。

图2 IGF-I基因TrulⅠ位点的酶切产物图

2.3 IGF-I基因TrulⅠ位点的基因型频率和基因频率分析由表1可知。在AA鸡中只存在AA基因型，在边鸡中AA基因型的频率高达0.993。在京海黄鸡和尤溪麻鸡中，AB基因型都为优势基因型，频率分别为0.560和0.600。京海黄鸡和尤溪麻鸡的优势等位基因分别为B和A，频率分别为0.530和0.600。卡方适合性检验，4个鸡品种在TrulⅠ位点都处于哈代-温伯格平衡状态（P＞0.05）。

2.45 ′调控区基因型分布的卡方独立性检验4个鸡品种5′调控区TrulⅠ位点的卡方独立性检验结果见表2。在4个鸡品种中的基因型分布并不一致。边鸡与京海黄鸡和尤溪麻鸡存在极显著差异（P＜0.01）。京海黄鸡与AA鸡差异极显著（P＜0.01），而与尤溪麻鸡差异不显著（P=0.162）。尤溪麻鸡与AA鸡差异极显著（P＜0.01）。

3 讨论

本研究表明，边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡IGF-I基因5′调控区TrulⅠ位点存在多态性，扩增产物43 bp处发生A到G的替换，而AA鸡在该位点表现为单态，这与王慧华等［13］的研究结果一致。在边鸡和尤溪麻鸡中A等位基因频率分别为99.7%和60.0%，A为优势等位基因；在京海黄鸡中B等位基因频率为53.0%，B为优势等位基因。4个鸡品种中的基因型分布并不一致，边鸡与京海黄鸡和尤溪麻鸡存在极显著差异，京海黄鸡与AA鸡差异极显著，而与尤溪麻鸡差异不显著。这可能和4个品种的经济类型不同有关，边鸡和尤溪麻鸡属于肉蛋兼用型，京海黄鸡是新培育的小型优质肉鸡，AA鸡为美国肉鸡品种。但边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡都处于Hardy-Weinberg平衡状态，可能是该位点未受选育的影响，在选育过程中它们的遗传仍然是随机的，或者是经过人工选育后经随机交配该位点又到达新的平衡。

表1 4个鸡品种IGF-Ⅰ基因5′调控区的基因型和等位基因频率

表2 4个鸡品种5′调控区TrulⅠ位点基因型分布的卡方独立性检验

另外，从本研究的结果中发现，在边鸡中虽然检测到Trul I位点的多态性，但AA基因型的频率达到99.3%，AB基因型的频率仅为0.7%，BB基因型的频率为0，结果并不理想。由于边鸡处于Hardy-Weinberg平衡状态，要想进一步研究Trul I位点和边鸡经济性状的关系，以及该位点能否作为边鸡经济性状的一个遗传标记，必须进行人工选择，提高B等位基因的频率，使3种基因型的样本数量达到要求。

4 结 论

边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡IGF-I基因5′调控区的TrulⅠ存在多态性，而AA鸡不存在多态性。由于边鸡的TrulⅠ位点多态性丰富性不足，该位点和边鸡经济性状的相关关系还需进一步研究。

［1］赵秀华，李满雨，王金玉，等.胰岛素样生长因子-Ⅰ基因与京海黄鸡生长和繁殖性状的关联分析［J］.中国畜牧兽医，2014，（7）：178-181.

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［4］Promwatee N，Laopaiboon B，Vongpralub T，et al.Insulin-like growth factor I gene polymorphism associated with growth and carcass traits in Thai synthetic chickens［J］.Genet Mol Res，2013，12（4）：4332-4341.

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Polymorphsims of the TrulⅠLocus in the 5′Regulator Region of IGF-I Gene of Different Chicken Breeds

ZHANG Xiang-qian，DONG Xin-long，LI Hong，LING Jiao-jiao，ZHANG Gen-xi*，WANG Jin-yu
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Jiangsu Yangzhou 225009，China）

The insulin-like growth factor I（IGF-I）is one of the important polypeptide growth factor in regulating animal life activities，it is important regulator of growth and metabolism to animals.One pair of primers were designed to amplify the 5'regulator region of IGF-I gene，based on the chicken DNA sequence of the IGF-I gene in the GenBank.PCR-RFLP was used to dectect the polymorphsims of the TrulⅠlocus in the Bian，Jinghai，Youxi and AA chickens，and try to explore the relationship between the polymorphisms of Trul I loci and economic traits of Bian chicken.The results showed that the Bian，Jinghai and Youxi chickens displayed polymorphisms，and AA chicken was monomorphic.AA，AB and BB genotypes were formed in the Jinghai and Youxi chickens.Only two genotypes（AA and BB）were detected in the Bian chicken.The genotypes distribution were not consistent in the four chicken Breeds. Whether the locus can be used as a genetic marker for economic traits in the Bian chickens needs further research.

insulin-like growth factor I；chicken；PCR-RFLP；polymorphsim

S831.2

：A

：0258-7033（2015）19-0001-03

2014-12-16；

2015-03-06

江苏省科技支撑计划（BE2013386）；国家自然科学基金（31201793）；国家肉鸡产业技术体系（nycytx-42-G1-05）

张向前（1991-），男，河南商丘人，硕士生，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：627446718@qq.com

*通讯作者：张跟喜（1981-），男，江苏溧阳人，副教授，E-mail：gxzhang@yzu.edu.cn