一起小尾寒羊绵羊痘的诊断

2015-04-18郝志香

中兽医学杂志 2015年12期

郝志香

(河南省新乡市动物疫病预防控制中心，河南新乡 453000)

绵羊痘病又名绵羊“天花”，是由羊痘病毒引起绵羊的一种急性、热性、接触性传染病，只感染绵羊。其特征是在病羊的口、唇、乳房、尾根等无毛或少毛部位皮肤粘膜发生痘疹。一般于冬末春初多发，死亡率高，对养羊业危害较大。2015年10月新乡市某羊场发生一起绵羊痘病例。

1 流行病学调查

该羊场共养殖有小尾寒羊130只，其中羔羊20只，起初只有羔羊发病，一周后成羊陆续感染，但是症状较轻微，只有精神不振，食欲减退情况，羔羊症状明显，发病羔羊精神不振，食欲减退，体温升高至40℃，眼睑红肿，咬牙，流口水，尾巴和四肢有红斑和丘疹，无腹泻，羔羊死亡率100%，抗生素治疗无效。初步怀疑感染小反刍兽疫病毒或者绵羊痘病毒。

2 实验室诊断

2.1 样品采集与处理

采集发病羊的鼻腔拭子和咽喉拭子各5份，置入1.5mL离心管内，加入500μL生理盐水充分混匀，8000rpm离心2min，取上清液100μL与1.5mL灭菌离心管中备用。

2.2 核酸提取

核酸提取采用RNA/DAN纯化试剂盒（购自世纪元亨），具体操作方法如下：取已处理样品，加入裂解液600μL,充分颠倒混匀，室温静置3～5min；将液体吸入吸附柱中，13000rpm离心30s；弃去收集管中的液体，加入600μL 洗液，13000rpm离心30s，重复一次；弃去收集管中液体，13000rpm空柱2min，以除去残留液；将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向中央加入洗脱液25～50μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，离心管中的液体即为病毒核酸模板。

2.3 小反刍兽疫病毒RT-PCR鉴定

小反刍兽疫病毒RT-PCR鉴定采用小反刍兽疫病毒RT-PCR检测试剂盒（购自国家外来动物疫病研究中心），具体操作方法如下：每份被检样品使用1个PCR反应管，每管中依次加入：RT-PCR反应液21μL，酶混合液1μL，被检样品中提取的病毒核酸模板溶液3μL，阳性对照用反应阳性对照品做模板（加3μL），阴性对照用无RNA酶污染的纯水做模板（加3μL），最终体积为25μL。加样后，将PCR管置于RCR仪内进行如下反应：50℃，30min进行反转录；然后94℃，2min进行Taq酶的激活；然后进行35个循环的PCR扩增（扩增条件为94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，30sec）；最后进行72℃，7min的延伸。RT-PCR反应结束后，取RT-PCR产物5μL在EB染色的1.5%琼脂凝胶中电泳，30min。电泳结束后，将琼脂凝胶置于凝胶成像系统中拍照。

2.4 绵羊痘病毒（SPPV）荧光PCR鉴定

绵羊痘病毒（SPPV）荧光PCR鉴定采用绵羊痘病毒（SPPV）核酸扩增试剂盒（PCR-荧光探针法）（购自广州维伯鑫生物科技有限公司），具体操作方法如下：每份被检样品使用1个PCR反应管，每管中依次加入：SPPV反应液20μL，酶液1μL，被检样品中提取的病毒核酸模板溶液4μL，阳性对照加阳性质控4μL，阴性对照加阴性质控4μL，总体积25μL，盖好管盖，短暂离心。将待检测PCR反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内，荧光通道选择：荧光通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道（QuencherDye）NONE，请勿选择ROX参比荧光。反应体系设置为25μL。循环参数设置：94℃，2min进行Taq酶的激活，不收集荧光信号；然后进行40个循环（94℃，15sec，不收集荧光信号；55℃，30sec，收集荧光信号）。

3 结果分析判定

3.1 小反刍兽疫病毒RT-PCR结果分析判定

结果判定标准：如果待检样品出现于阳性对照大小一致的扩增条带（大小约为350bp），则结果判为普通RT-PCR阳性，否则结果判为普通RT-PCR阴性。电泳后用凝胶成像系统观察（江苏捷达），见图1。阳性对照在Marker2000标示的250bp到500bp之间出现了一条亮带，阴性对照和待检样品均无亮带，判为小反刍兽疫普通RT-PCR阴性，说明该羊群未感染小反刍兽疫病毒。