张 仁，张圣洁，张学研，李 彤，臧文巧

郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室 郑州 450001

CLPTM1L与miR-494靶向关系的双荧光素酶报告实验验证

张 仁，张圣洁，张学研，李 彤，臧文巧#

郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室 郑州 450001

#通信作者，女，1979年8月生，博士，副教授，研究方向：食管癌病因学，E-mail: zangwenqiao@sina.com

miR-494; CLPTM1L; 双荧光素酶报告系统

目的：确定miR-494与CLPTM1L的靶向关系。方法：采用生物信息学方法预测miR-494与CLPTM1L基因的结合位点。采用PCR技术扩增CLPTM1L基因3’UTR片段，并克隆至pmirGLO载体，构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒。将培养的293T细胞分为4组，分别共转染miR-494或阴性对照和pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR或pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR，检测4组细胞中荧光素酶活性。结果：酶切和测序证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR；与共转染miR-494 mimics和突变型CLPTM1L 3’UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(1.056 4±0.163 4)、共转染阴性对照序列和突变质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.961 3±0.177 9)或野生型质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.983 4±0.001 2)相比，共转染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3’UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明显降低(F=4.476，P=0.040)，其他3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：CLPTM1L与miR-494存在靶向关系。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一组内源性的、高度保守的非编码RNA，通过与mRNA 3’非编码区(3’UTR)结合,进行转录或转录后调控,从而调控靶基因的表达[1-2]，进而参与一系列生物学过程,如脂肪代谢、细胞分化、凋亡等[3-4]。作者通过生物信息学方法分析了唇腭裂跨膜1样蛋白(cleft lip and palate transmembrane 1 like，CLPTM1L)基因与miR-494的靶向关系，并进一步应用双荧光素酶报告实验来验证miR-494对CLPTM1L的靶向调控作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肾上皮细胞系293T细胞株购自ATCC公司，T4 DNA 连接酶、限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ、Taq DNA 聚合酶、dNTP 购自TaKaRa 公司，DH5α感受态大肠杆菌购自Solarbio公司；P……