四唑染色法测定巨紫荆种子生活力

2015-04-17凌敏杨秀莲王良桂

江苏农业科学 2015年1期

凌敏　杨秀莲　王良桂

摘要：为探讨巨紫荆（Cercis gigantea）种子生活力的适宜测定方法，采用四唑染色法，以染色浓度、染色温度、染色时间设计正交试验，研究巨紫荆种子的生活力测定条件。结果表明，染色浓度、染色温度、染色时间3者之间存在一定的关系，TTC浓度为0.1%、温度为35 ℃、染色时间为8 h是巨紫荆种子生活力测定的最佳条件。

关键词：巨紫荆种子；四唑染色；生活力

中图分类号： S339.3+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0295-03

收稿日期：2014-03-05

基金项目：江苏省林业三新工程项目（编号：lysx[2013]24）。

作者简介：凌敏（ 1990—），女，安徽滁州人，硕士研究生，研究方向为园林植物与应用。E-mail：974574883@qq.com。

通信作者：王良桂，教授，博士生导师。E-mail：wlg@ njfu.com.cn。巨紫荆（Cercis gigantea）原产中国浙江、河南、湖北、广东、贵州等地，是现存极少的乡土树种。巨紫荆是高大落叶乔木，高可达15 m，胸径可达40 cm。树干通直，生长整齐，枝展开张，树冠绿荫面积大，覆盖度高，园艺性状突出，适宜作行道树、庭荫树，艺术效果良好。巨紫荆春季满树开淡红或淡紫红花，先花后叶，灿若云锦，观赏效果极佳；夏季叶绿荚红，茵质浓厚；秋季彩叶如霞；冬季落叶后荚果仍然悬挂枝头，尽展生命之劲力。巨紫荆实乃春季观花、夏秋观叶、冬季观果的优良园林树种，是园林绿化中具有广阔应用前景的乡土树种[1]。在小苗培育方面，巨紫荆的出苗率一直不高，播种前用浓硫酸酸蚀再用赤霉素浸泡，其发芽率最高仅有25.5%[2]。准确的生活力测定方法能够真实反映种子的发芽能力，尤其对一些休眠期长的种子更为适用。四唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）测定技术是通过鉴定种子内部活组织的染色情况测定种子活力，是国际上公认的测定种子生活力较好的方法，能够快速、有效、准确地反映出种子的生活力，是《国际种子检验规程》中用于测定发芽缓慢或有休眠种子的生活力、快速判断种子潜在发芽能力的一种有效方法[3-5]。

本研究利用四唑染色法，设置不同的TTC 浓度、染色温度和时间，研究巨紫荆种子生活力测定的适宜条件，探究巨紫荆种子生活力的快速测定方法，为客观评价巨紫荆的发芽能力，科学预测种子用量以及出苗率等提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料

巨紫荆种子于2013年11月12日采自南京林业大学梁希广场前，种子的净度为96.12%，千粒质量为21.50g，含水量为17.15%。

1.2TTC染色法

1.2.1正交试验采用正交试验设计方法，确定巨紫荆种子生活力测定的适宜条件。选择 TTC 浓度、染色温度（烘箱温度）和时间等直接关系种子活力测定结果的3个因素，并设置3个不同的水平，进行正交试验（表1）。

表1TTC染色法测定因素与测定水平

水平因素A：TTC浓度

（%）B：染色温度

（℃）C：染色时间

（h）10.1025820.15301230.203516

1.2.2TTC溶液配制用超纯水分别将 TTC 配成0.1%、015%、0.2%浓度的溶液，pH 值范围为 6.8～7.2，保存于棕色瓶中。

1.2.3浸泡处理随机抽取27份巨紫荆种子，每份50粒，去子叶末端，放置于27个烧杯中，加入25 mL自来水中淹没种子，置于25 ℃恒温培养箱中24 h，待其吸水膨大后取出，用刀片及解剖针剥去种子的3层种皮，取出胚，供染色用。整个操作过程中，所有的种子都置于湿润的脱脂棉上，以保证种子的湿润。

1.2.4染色将准备好的每份50粒种胚分别放入27个小烧杯中，共9个处理，每个处理重复3次，加入对应的TTC溶液，分别放入25、30、35 ℃的烘箱中避光染色。达到染色时间后，取出种胚，用清水冲洗，将种胚摆在滤纸上，根据种子染色的部位、染色面积的大小和染色程度，逐粒判断种子的生活力[6]。

1.3TTC浓度试验

在35 ℃条件下，进行了不同浓度的TTC液（03%、04%、05%）对种子染色数目、染色时间及染色程度的比较试验。

1.4种子发芽与生活力测定

根据不同的处理方法将随机抽取的巨紫荆种子分为2大组10小组。（1）98%浓硫酸处理组：处理时间分别为10 min（处理1）、15 min（处理2）、20 min（处理3）、25 min（处理4）、30 min（处理5），处理对应时间后，再分别置于流水下冲洗 48 h。（2）热水浸泡48 h组：浸泡温度分别为50 ℃（处理6）、60 ℃（处理7）、70 ℃（处理8）、80 ℃（处理9）、90 ℃（处理10）。每组3个重复，每个重复100粒，处理完毕后进行发芽试验，将种子置于湿润的砂子中，25 ℃培养温度，每天光照 12 h，光照强度为1600 lx，期间保持发芽盒内砂子湿润[7]。

2结果与分析

2.1TTC浓度、染色温度和染色时间对种子生活力的影响

采用四唑染色法测定巨紫荆种子生活力的正交试验 L9（33）试验结果见表2。巨紫荆种子生活力最高（99.33%）的处理组合为0.15%TTC浓度、35 ℃染色温度、8 h染色时间（处理组合6），以及0.20% TTC浓度、35 ℃染色温度、12 h染色时间（处理组合9）；生活力最低（0.67%）的处理组合为0.10% TTC浓度、25 ℃染色温度、8 h染色时间（处理组合1），低于最高生活力98.66%。endprint

将所得数据进行方差分析，结果见表3。染色温度以及染色时间的F值（53.72、20.78）均远大于F0.01（3.92），表现差异极显著；TTC浓度的F值（1.63）小于F0.01，差异不显著。3个因素对巨紫荆种子生活力的影响大小排序为温度>时间>TTC 浓度。

各因素不同水平的种子生活力平均值比较结果见表4。随着TTC浓度升高，种子的活力呈现先上升后下降的趋势，但是其变化幅度不大，从节省原料的角度出发，可以考虑选择低浓度的TTC；染色温度越高，巨紫荆种子的活力越高，当温度为35 ℃时，巨紫荆种子的活力达到98.66%，而且随着温度升高，差异显著，35 ℃条件下巨紫荆种子的活力比30 ℃条件下提高了38.88%；随着染色时间延长，种子活力也上升，表现差异显著，但相对于温度来说，其影响程度还是很小。综上所述，结合节约资源、减少污染的实际情况，TTC 法测定巨紫荆种子生活力的最佳条件为0.10% TTC浓度溶液，在 35 ℃ 烘箱中染色8 h。

表2TTC染色法正交试验结果

处理组合因素ABC种子活力

（%）11110.67212261.33313397.3342122.00 522397.33623199.33731364.67832120.67933299.33

表3TTC浓度、温度、浸种时间处理的巨紫荆种子

生活力测定方差分析

来源dfSSMSF值F0.01因素A2198.7499.371.633.92因素B26536.973268.4853.72因素C22528.071264.0420.78误差271642.5460.84

2.2TTC浓度与染色时间的关系

不同浓度TTC液（0.3%、0.4%、0.5%）对种子染色数目、染色时间及染色程度的比较试验结果见表5。

表4不同水平的巨紫荆种子生活力平均值比较

水平种子生活力平均值（%）TTC浓度染色温度染色时间153.11c22.45c40.22c266.22a59.78b54.22b361.56b98.66a86.44a注：同列中不同小写字母表示在P<0.05水平上表现差异显著。

表5不同浓度TTC液的染色情况

TTC浓度

（%）试验种子数

（粒）染色种子数

（粒）着色稳定时间

（h）0.3504960.4505040.550494

结合TTC浓度试验结果，可以看出只要染色温度适宜，TTC浓度对巨紫荆种子活力的影响不大，不论浓度高或低，均能染色；TTC浓度高时，可以缩短染色时间。出于节约试剂、减小污染的目的，在试验时尽可能选择较低浓度染色。根据上述结果，TTC 法测定巨紫荆种子生活力的最佳条件与正交试验结果一致。

2.3种子发芽率与种子生活力的关系

试验进行30 d 后种子均未见萌发，继续观察1个月后，仅有个别种子开始出现霉烂现象，但是仍然没有萌发迹象。此时每个处理随机抽取 50 粒种子，用四唑染色法测定其种子的生活力。由表 6 可知，绝大多数成熟的巨紫荆种子具有良好的生命活力；在进行发芽试验时，适当的处理方法对种子之间生活力影响不大。

表6巨紫荆种子生活力测定结果

处理有生活力种

子数（粒）无生活力种

子数（粒）发芽种子数

（粒）发霉种子数

（粒）1482002491003455004462025431246473007500008473009454011042404

3结论与讨论

种子生活力反映了种子的发芽潜在能力和种胚所具有的生命力，是判断种子质量的重要指标[8]。四唑染色法是国际公认较好的测定种子活力的方法，已广泛应用于农作物和蔬菜种子的活力测定。由于TTC浓度、染色温度以及染色时间等的不同都会影响种子的活力判断，因此针对不同植物种子需要确定不同的活力测定条件。对巨紫荆种子生活力进行测定前，对测定巨紫荆种子生活力的TTC浓度以及染色温度作了简单的对比，结果表明当TTC浓度低于0.10%、染色温度高于50 ℃时，巨紫荆种子不染色或者染色情况较差，故试验时将TTC浓度设置高于0.10%，染色温度低于50 ℃。

TTC浓度、染色温度、染色时间均为影响巨紫荆种子生活力的重要因素，其中染色温度及时间对生活力的影响极显著，在生活力测定中存在一定的线性关系，可以通过改变TTC浓度、染色温度、染色时间其中的两者而达到改变第3条件的目的[9]。染色温度为生活力测定的最主要限制因子，控制好染色温度对巨紫荆种子生活力的测定具有重要意义。

从节约成本减少污染角度出发，可以通过降低TTC浓度、提高染色温度达到良好的染色效果[10]。生产上可根据实际情况，选择适宜的染色浓度（0.1%～0.2%），在35 ℃下染色8 h或者在较高浓度（0.3%～0.5%）下于35 ℃染色4～6 h。根据本试验研究结果，种子生活力的最佳测定条件为0.1% TTC浓度溶液、 35 ℃染色温度、8 h染色时间。

前人试验表明，TTC 染色法测定结果与标准发芽率一般很接近，是最有希望代替发芽试验的方法[11-13]。但本研究结果表明，巨紫荆种子生活力和其发芽试验结果相差很大，TTC 染色法还不能取代巨紫荆种子的发芽试验。这主要在于巨紫荆种子萌发还没有建立起标准的发芽方法，在后续的试验中将对巨紫荆种子萌发的相关生理特性进行深入研究，以提高其生活力测定结果判定的准确性，从而为估测巨紫荆种子发芽率提供一种准确、快速、简便和适用的新方法。

参考文献：

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