张小飞　孙颖杰　贾赟　等

摘要：牙鲆弹状病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）可以引起牙鲆、香鱼等肌肉组织器官及内脏出血，造血器官坏死，给鱼类养殖带来巨大经济损失。HIRRV具有囊膜，属于弹状病毒科粒外弹状病毒属。病毒基因组为单股负链的RNA，长约11 000 bp，主要包含5个基因，可编码核蛋白（nucleoperotein，N）、磷蛋白（phosphoperotein，P）、基质蛋白（matrix preotein，M）、糖蛋白（glycoperotein，G）、依赖RNA的RNA酶（RNA polymerase protein，L）和非结构蛋白（non-virion perotein，NV）。本文就目前国内外关于HIRRV的流行特点、生物学特征、分类地位、基因组及其蛋白产物的特征以及检测方法等方面进行了较为全面的概述，旨在为该病的预防、控制以及致病机理方面的研究提供依据。

关键词：牙鲆弹状病毒；基因组；编码蛋白；检测方法

中图分类号： S941.41文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0231-03

收稿日期：2014-03-21

基金项目：国家自然科学基金（编号：41276174）。

作者简介：张小飞（1990—），女，河南宝丰人，硕士研究生，从事海洋生物疫病研究。Tel：（0411）82583668；E-mail：longlongai3227@163.com。

通信作者：贾赟，高级兽医师，从事动物传染病检测、防制研究。E-mail：jxy750921@163.com。牙鲆弹状病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）为单股负链RNA病毒，是弹状病毒科粒外弹状病毒属新成员，流行病学上表现为低温（≤15 ℃）发病，主要感染牙鲆、香鱼，感染鱼其鳍、肌肉组织及内部器官出血，造血器官坏死；人工感染对黑鲷、无备平鲉和虹鳟等海水鱼类或降河洄游鱼类具有强烈致病性，给全球海水养殖业造成了严重的经济损失[1-2]。根据《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》，进出境的鲈鱼、真鲷、牙鲆、大菱鲆、鲤鱼、鲫鱼等养殖和种苗用鱼种，均要进行HIRRV疫病检测，口岸安全意义重大。国外对HIRRV的研究相对较早，而国内目前研究主要集中在病毒分离、基因组测序和分子诊断方法的建立等方面工作[1-2]，研究内容相对局限。本文就目前国内外关于HIRRV的流行特点、生物学特征、分类地位、基因组及其蛋白产物的特征以及检测方法等方面进行了较为全面的概述，旨在为该病的预防、控制以及致病机理方面的研究提供依据。

1发现及流行

1986年，首次在日本兵库县的患病牙鲆和香鱼鱼苗中分离得到HIRRV日本株（8401-H）[3]，1987年Sano等在香鱼（Plecoglossus altivelis）、黑鲷（Milio macrocephalus）、无备平鲉（Sebastes inermis）中也发现了HIRRV[4]。1997年、2007年又分别在韩国南部海域的牙鲆和中国山东荣成的石鲽幼鱼中发病，并经分离得到HIRRV韩国株（CA-9703）和中国株（SR080113）[1，5]。HIRRV主要感染海水鱼，但 1992年Oseko等试验发现HIRRV对部分淡水鱼同样具有致病性[6]，不过在淡水鱼养殖方面目前还没有发现该病毒。直到2012年EURL会议（16th Annual Meeting of the National Reference Laboratories for Fish Diseases）报告指出HIRRV在中国淡水鱼养殖中已经广泛传播。2013年Borzym等在欧洲的河鳟鱼（淡水鱼）中分离得到了HIRRV病毒（j.No.207237），经过测序分析发现欧洲株和中国株P基因的同源性达到99%，L和N基因的同源性在99%以上[7]，有学者认为HIRRV欧洲株很可能是通过冷冻食品由中国进入欧洲。

2生物学特征

HIRRV病毒粒子呈弹状，为弹状病毒典型的形态学特征，病毒粒子长160～180 nm，宽60～80 nm。基因组长度约为11 000 bp[1，5]，主要与核蛋白（N） 结合形成核衣壳，呈螺旋对称，在核衣壳上还结合有少量的聚合酶（L） 和磷蛋白（P）；囊膜，紧密地包裹着核衣壳，囊膜由脂质和蛋白质组成，其内表面为基质蛋白（M），囊膜上有糖蛋白（G） 突起。成熟的病毒粒子通过细胞膜出芽，释放到胞膜外。

该病毒能够在EPC（鲤鱼上皮瘤细胞系）、FHM（肥头鲤细胞系）、CHSE-214（大鳞大马哈鱼胚胎细胞系）、CO（草鱼卵巢细胞系）、CIK（草鱼肾细胞系）、BF-2（蓝鳃鱼幼鱼细胞系）、R1（虹鳟肝细胞系）、SSN-1（纹鳢细胞系）等鱼类细胞上增殖，并出现细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE），其中FHM、EPC、BF-2、CHSE-214最为敏感，最大滴度达到107 TCID50/100 μL；该病毒的最适生长温度为20 ℃，仅2 d就能病变完全，而且病毒滴度达到109 TCID50/100 μL[8]。该病毒的感染活性可以被pH值（3.0和9.0）、脂溶剂（三氯甲烷）以及热（56 ℃，30 min）等破坏。

3分类地位

1991年，Nishizawa等发现HIRRV由N、P、M、G、L 等5个结构蛋白构成，其蛋白质电泳图谱和狂犬病毒属相似，把HIRRV归到弹状病毒科的狂犬病毒属[9]。直到1997年Kurath等发现G基因和L基因之间存在NV基因[10]；2000年国际病毒学分类委员会（ICTV）第7次报告中，正式把HIRRV列为弹状病毒科的一个新属——粒外弹状病毒属[11]。粒外弹状病毒属病毒在其糖蛋白和聚合酶蛋白之间均存在一个独特的非结构蛋白，该蛋白存在于受感染的细胞中，但不存在于成熟的病毒粒子中，这也是粒外弹状病毒区别于水疱病毒的一个主要标志[12]。

4基因组及其蛋白产物的特征

4.1基因组特征

HRV基因组的测序工作起始于P和M基因[13]，目前，HIRRV的全基因组序列已经测定，基因组大小约11 000 bp[1，5，14]，基因组含有6个开放阅读框（ORFs），分别编码6种蛋白：核蛋白（nucleoperotein，N）、磷蛋白（phosphopero tein，P）、基质蛋白（matrix preotein，M）、糖蛋白（glycoperotein，G）、依赖RNA的RNA酶（RNA polymerase protein，L）和非结构蛋白（non-virion perotein，NV）（表1） [5]。

表1HIRRV韩国株（CA-9703）基因组中6种基因的特征

基因位置

（bp）上游非翻

译区（nt）下游非翻

译区（nt）蛋白长度

（aa）蛋白分子

量（ku）N62～1 4075510539242.5P1 409～2 179443622725.8M2 234～2 815585319321.6G2 882～4 492354250856.6NV4 494～4 87003411112.7L4 872～10 96147751 987225注：蛋白长度和蛋白分子量是有开放阅读框直接翻译的推算的蛋白质，没有经过磷酸化或糖基化的转录后修饰。

基因结构是由3′端非翻译前导（Leader）区、基因区、基因间连接区及5′端非转录拖尾（Trailer）区组成。排列方式为3′Leader-N-P（M1）-M（M2）-G-NV（非结构蛋白）-L-Trailer 5′（图1）[1，5]。HIRRV的前导区含有位于54～60的多聚腺苷酸化信号（UAUCUUUUUUU），而拖尾区中含有L基因转录终止和多聚腺苷酸化信号，且基因组3′端和5′端呈反向互补，这是非节段负链RNA病毒的共同特征，可能对平衡病毒的转录和复制过程其重要作用（图2）[5，15]。

基因间的连接区内含有高度保守的上游基因和多聚腺苷酸化信号、下游基因转录起始信号以及转录和起始信号间的间隔序列[16]。HIRRV基因间连接区的保守序列为AGATAG（A）7TGGCAC（N）4GTG[17-18]，其中AGATAG（A）7为转录终止和多聚腺苷酸化信号；基因间的间隔序列一般只含有1个核苷酸（U或G）[19]，这些调节信号和基因间区域在HIRRV和其他粒外弹状病毒属成员之间都是一致的，但区别于弹状病毒科的其他属。

4.2编码蛋白的特征

N蛋白是病毒粒子中含量最丰富的蛋白，它和病毒RNA紧密结合，形成核糖核蛋白体N-RNA结构，并构成转录和复制的模板，在转录调节中起着重要的作用。

P蛋白是和聚合酶相关的磷酸化蛋白，它与N蛋白和L蛋白相互作用，在转录和复制过程中起着关键的作用[20-21]。该蛋白根据序列推算的pI为8.68[18]，而根据等点聚焦推算出来的pI为7.3～7.4[22]，这可能是因为鱼类细胞所产生的蛋白磷酸化程度有关。P蛋白以分子伴侣的形式与N蛋白结合，阻止N蛋白自身聚集，从而保证N蛋白以可溶性的分子存在[23-25]，同时也能阻止N蛋白与非特异性的RNA结合[26]。

M蛋白在病毒出芽过程中，核衣壳与G蛋白相互作用，起始病毒的装配。然后与M蛋白结合形成核衣壳-M蛋白结合物，完成病毒装配，出芽形成子病毒，进而感染其他细胞[27]。

G蛋白是病毒的主要抗原，能诱导产生中和抗体和刺激细胞免疫，因此通常选择G基因作为抗原基因来构建DNA疫苗。Yasuike等比较HIRRV G蛋白疫苗和N蛋白疫苗的免疫效果，发现G蛋白疫苗比N蛋白疫苗更能引起一系列的免疫反应[28]，但是G蛋白和N蛋白疫苗的具体免疫机制还不太清楚，有待进一步的研究。

NV蛋白是粒外弹状病毒属所特有的非结构蛋白，仅存在于感染细胞中，不存在于成熟的病毒粒子中。Johnson等利用反向遗传技术构建NV基因突变的重组SHRV病毒，发现重组的SHRV与野生型病毒具有相同的感染力及行态，从而证实了NV基因对SHRV的复制没有重要影响[29]。Biacchesi等将IHNV病毒NV基因替换成GFP（绿色荧光蛋白）或CAT（氯霉素乙酰转移酶）基因，病毒的复制不受影响[30]。有学者认为NV基因并不是病毒在细胞的生长过程中所必须的，同时对病毒在体内的致病性也不起重要作用[31]。例如，Chiou等在2000年首次发现NV基因在细胞培养过程中与细胞病变（使细胞变圆）相关[32]。最近也有研究表明IHNV的NV基因对IHNV在细胞中的最佳复制起着关键的生物作用，同时与IHNV的致病性有关[33]，但有关NV蛋白的具体作用尚有待进一步深入的研究。

L蛋白病毒最大的结构蛋白，也是病毒RNA依赖的RNA聚合酶，具有多种酶活性，包括核苷酸聚合活性、甲基化转移酶和鸟苷转移酶活性、以及多聚腺苷酸转移酶活性等。

5牙鲆弹状病毒检测方法

目前，病毒的检测方法主要有三大类，分别是细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术，其中细胞学诊断技术主要包括细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作复杂、检测周期长且灵敏度低。免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫斑点印迹杂交，其方法具有特异性高、灵敏度强等特点，但是过程也相当复杂，不适宜对大量样品的检测。分子生物学方诊断技术主要包括聚合酶链式反应（PCR）、实时定量RT-PCR、环介导的恒温扩增技术（LAMP），利用该技术鉴定病原具有快速、准确、灵敏度高等优点，目前应用较为广泛，如孙颖杰等根据G蛋白的序列建立了检测HIRRV的RT-PCR、实时定量-PCR、LAMP方法[34]。

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