孙建梅　郑桂红　刘缠民　等

摘要：为了评价水环境中Ni2+对鱼类的影响，并为预防和治理淡水渔业水质资源的镍污染提供一定的理论依据，采用静水生物测试法，研究0、10、25、50、100 mg/L NiSO4·6H2O对鲫鱼肝胰脏和肠中酶活性的影响。结果表明：低浓度的NiSO4·6H2O对肝胰脏中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶有激活作用，在高浓度时呈抑制作用；而对碱性磷酸酶一直表现为抑制作用。低浓度的NiSO4·6H2O对肠中胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP有激活作用，高浓度时呈现出抑制作用。

关键词：硫酸镍；鲫鱼；肝胰脏；肠；酶活性

中图分类号： S965.117；S917.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0239-03

收稿日期：2014-03-07

基金项目：江苏省徐州市科技计划（编号：XF11C051）；江苏省化学生物学优势学科基金（编号：PAPD）。

作者简介：孙建梅（1962—），女，江苏徐州人，副教授，从事动物学的教学和科研工作。

通信作者：郑桂红，女，山东郓城人，博士研究生，讲师，从事动物生理学的教学和科研工作。E-mail： ghzhenghf@163.com。随着工业的迅速发展，大量的铅、镉、镍、汞等重金属随污水流入江海湖泊，严重破坏了水域生态环境，影响鱼类的正常生长繁殖[1]。目前，关于镍和其他重金属毒理学的研究多集中在致死浓度与水生动物体内镍的积累量等方面，而重金属离子对鱼类消化酶活性影响的研究较少[2]。因此，本研究以野生鲫鱼肝胰脏和肠中脂肪酶、胰蛋白酶、AKP和ACP为指标，研究不同浓度的NiSO4对鲫鱼肝胰脏和肠中酶活性的影响，旨在研究Ni2+对鱼类消化酶的影响机制，为保证鱼类的健康和防治环境污染提供一定的理论参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物野生鲫鱼，购自江苏徐州文沃市场，选择健康活泼、体表完好的鲫鱼100尾，体长（9±2） cm、体质量（20±2） g/尾，随机分为5组，分别为0、10、25、50、100 mg/L NiSO4[3]。放养于室内水族箱中，每箱88 L水，以充分曝气 3 d 的自来水作为静水水源，24 h持续充氧，溶氧量为6 mg/L，保持水温（23±1） ℃、pH值 68。采用静水法将鲫鱼预饲养1周，预试验期间死亡率低于5%，试验前24 h停止饲喂，试验期间不换水。

1.1.2药品和试剂蛋白定量测试盒（100T/96样）、脂肪酶测试盒（50T/48样）、胰蛋白酶测试盒（50T/48样）、酸性磷酸酶（ACP）测试盒（50T/48样），以上均为南京建成生物工程研究所产品；碱性磷酸酶（AKP）测试盒（50T/48样），0.9%生理盐水，NiSO4·6H2O。

1.1.3试验仪器YV-7504单光束紫外-可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）、电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、BS 124S型电子天平[0.1 mg～120 g，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]、玻璃匀浆器、微量移液枪（1、0.1 mL）等。

1.2试验方法

随机抽取毒性试验96 h之后的鲫鱼（至少3尾），解剖取样，对肝胰脏中各指标进行测定，评价NiSO4对鲫鱼的影响。

1.3数据处理

试验数据用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行处理。组间数据的两两比较采用配对样本进行t检验，P<0.05、P<001表示差异显著、极显著。

2结果与分析

2.1NiSO4对鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶活性的影响

由表1可知，随着NiSO4浓度的升高，蛋白浓度呈上升趋势，且NiSO4浓度越高，蛋白浓度上升越明显。在NiSO4浓度为50 mg/L时，蛋白浓度显著上升；在NiSO4浓度为100 mg/L时，蛋白浓度极显著上升（P<0.01）。当NiSO4浓度≤25 mg/L 时，胰蛋白酶活性增强；但当NiSO4浓度≥50 mg/L 时，胰蛋白酶活性减弱。可见，低浓度NiSO4对胰蛋白酶活性有促进作用，高浓度NiSO4对其有抑制作用，其中10、100 mg/L NiSO4处理的胰蛋白酶活性与对照差异显著（P<0.05），25 mg/L NiSO4处理的胰蛋白酶活性与对照差异极显著（P<0.01）。当NiSO4浓度≤25 mg/L时，脂肪酶活性缓慢增强；但当NiSO4浓度≥50 mg/L时，脂肪酶活性急剧减弱。可见，低浓度NiSO4对脂肪酶活性有细微的促进作用，高浓度NiSO4对其具有明显的抑制作用，其中25 mg/L NiSO4处理的脂肪酶活性与对照差异显著（P<0.05），100 mg/L NiSO4处理的脂肪酶活性与对照差异极显著（P<0.01）。当NiSO4浓度≤25 mg/L时，酸性磷酸酶活性呈增强趋势，但在50 mg/L之后，酶活性减弱。可见，低浓度NiSO4对酸性磷酸酶活性有促进作用，高浓度NiSO4对其有抑制作用，其中25、100 mg/L NiSO4与对照差异显著（P<0.05）。碱性磷酸酶活性在NiSO4浓度为10 mg/L时就表现出减弱的趋势，且随着NiSO4浓度的升高而减弱得更明显，在NiSO4浓度为10～50 mg/L 之间时，碱性磷酸酶活性减弱最明显，其中25、50、100 mg/L NiSO4与对照差异显著（P<0.05）。表1镍对鲫鱼肝胰脏中胰蛋

由表2可知，随着NiSO4浓度的升高，蛋白浓度呈上升趋势，而且浓度越高，蛋白浓度上升越明显，其中25、50、100 mg/L NiSO4 处理的蛋白浓度与对照差异显著（P<005）。当 NiSO4 浓度≤50 mg/L时，胰蛋白酶活性增强；但当NiSO4 浓度>50 mg/L 时，胰蛋白酶活性反而会减弱，可见低浓度NiSO4 对胰蛋白酶活性有促进作用，高浓度NiSO4 对其有抑制作用，其中25、100 mg/L NiSO4 处理与对照差异显著（P<0.05），50 mg/L NiSO4 处理与对照差异极显著（P<001）。当NiSO4 浓度>50 mg/L 时，脂肪酶活性呈缓慢增强的趋势，但当NiSO4 浓度达到100 mg/L时，脂肪酶活性急剧减弱，可见低浓度 NiSO4 对脂肪酶活性具有细微的促进作用，高浓度 NiSO4 对其具有明显的抑制作用，其中10、25 mg/L NiSO4 处理与对照差异极显著（P<0.01），50、100 mg/L NiSO4 处理与对照差异显著（P<0.05）。当 NiSO4浓度 ≤50 mg/L 时，酸性磷酸酶活性呈增强的趋势，但当其浓度达到 100 mg/L 时，酸性磷酸酶活性减弱，可见低浓度 NiSO4 对酸性磷酸酶活性有促进作用，高浓度 NiSO4 对其具有抑制作用，其中50 mg/L NiSO4 处理与对照差异显著（P<0.05）。当NiSO4 浓度在10～50 mg/L之间时，碱性磷酸酶活性逐渐增强，但当其浓度达到100 mg/L时，其活性反而减弱了。酶活性的增强，说明前期对酶有促进作用；后期酶活性开始减弱，表示其对酶出现了抑制作用（P<0.01）。表2镍对鲫鱼肠中酶活性的影响

3结论与讨论

研究结果表明，鲫鱼肝胰脏中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性在低浓度NiSO4中有所增强，但随着NiSO4浓度的增加，几种酶的活性明显减弱；碱性磷酸酶则一直呈减弱趋势。可见，在长时间的高浓度NiSO4 胁迫下，鲫鱼与植物、哺乳动物[4]类似，其脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性受到了抑制，而碱性磷酸酶活性对NiSO4的影响具有不同的反应，其生理机制还有待于从酶活性调控的分子水平上进行更深入的研究。本研究中的各种酶活性与NiSO4浓度升高的关系同贾秀英进行的铅对鲤鱼的研究结果[5]一致，脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性随时间变化规律与黄雪琴等的结果[6]一致，随着中毒时间的延长，酶活性有所减弱。

鱼类肝胰脏是重要的解毒器官，也是主要蓄积重金属的部位，重金属离子可以诱导肝胰脏产生金属硫蛋白[7]，从而降低重金属的毒性，减少对肝胰脏的损害，但是随重金属离子浓度的增加和时间的延长，这种损害会超过金属硫蛋白解毒的能力，从而抑制肝胰脏的代谢酶活性。本研究结果表明，肝胰脏中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性在高浓度NiSO4胁迫下明显减弱，说明高浓度NiSO4超出了肝胰脏本身的解毒能力，极大地抑制了脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶的活性。Glzar等研究发现，高浓度铅会明显抑制罗非鱼碱性磷酸酶活性[8]，本试验结果与其相似；孔祥会等研究发现，高浓度汞会明显抑制肝胰脏碱性磷酸酶活性[4]。

肠为鱼类重要的消化器官，肠道的健康、酶的工作状态都关系到鱼的正常生长和发育。肠道是鱼类疾病传染的重要途径之一，肠道功能的下降会导致整个机体的健康水平下降，对营养物质的吸收能力也会下降，使大量营养物质流入水体，造成整个水体的健康水平下降，使鱼类的传染病经常发生，严重影响鱼类的生存，对整个鱼类养殖具有严重的破环作用。

脂肪酶和胰蛋白酶为肠中重要的消化酶，脂肪酶活性的减弱对整个机体的影响是巨大的。脂肪酶是鱼肠中重要的消化酶，对鱼类营养物质的吸收有至关重要的作用[9-11]。ACP和AKP在蛋白（酶）的去磷化过程中起了很大的作用，在生物对营养物质的吸收消化和运输[12]中也起重要作用，此外还是生物体内重要的解毒体系[13]。研究Ni2+对脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的影响，有助于了解Ni2+对鲫鱼肠中酶以及鲫鱼生长发育的影响，可作为水源镍污染监测的一种生物学指标。

本试验结果表明，鲫鱼肠中胰蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的活性都随着NiSO4浓度的增加而呈先增强后减弱的趋势。当NiSO4浓度为0～50 mg/L时，胰蛋白酶、脂肪酶、碱性和酸性磷酸酶均呈增强趋势，说明该浓度的NiSO4对酶具有激活作用；但当NiSO4 浓度为50～100 mg/L时，各酶的活性则呈减弱的趋势，表明对各酶的活性产生了抑制作用。还有其他类似的试验均得出了“酶活性随着浓度的增加呈先增强后减弱”的结论，例如，NiSO4对大鼠心肝肾 ATPase毒性的试验研究[14]、铅对鲫鱼酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的影响[7]、镍及其化合物对人和动物的毒性作用[15]、重金属Cd胁迫对红树蚬的抗氧化酶、消化酶活性和MDA含量影响[16]等。由此可见，低浓度 NiSO4 对胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP具有不同程度的激活作用，高浓度 NiSO4 对其具有抑制作用。结合相关文献可知，可能是因为低浓度NiSO4 会改变酶的分子结构，使酶活性增强；高浓度NiSO4 会破坏酶的结构，使酶的活性受到抑制。其中，NiSO4 对脂肪酶、胰蛋白酶和AKP的影响极显著（P<0.01），对其的毒性作用很大；对酸性磷酸酶的影响较小。目前还没有人研究过镍对鲫鱼肠胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP的影响，因此笔者通过研究 NiSO4 对鲫鱼肠酶的影响，以期为鲫鱼的养殖和保护以及水域的污染状况提供更多的资料。

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