符策奕，张泽华，张爱联，罗进贤

（1.海南省食品药品检验所，海南 海口 570216；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101；3.中山大学，广东 广州 510275）

血管生成抑制素治疗血管瘤的研究

符策奕1，张泽华2，张爱联2，罗进贤3

（1.海南省食品药品检验所，海南 海口 570216；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101；3.中山大学，广东 广州 510275）

目的 观察血管生成抑制素治疗血管瘤的效果。方法发酵毕赤酵母工程菌组成型表达重组血管生成抑制素，用SP-Sepharose Fast Flow(阳离子交换剂)柱进行蛋白纯化；通过抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成试验和诱发血管内皮细胞凋亡试验，分析重组血管生成抑制素的生物学活性，在血管瘤模型(公鸡肉垂)中注射血管生成抑制素，分析血管生成抑制素对血管瘤的药效。结果血管生成抑制素在毕赤酵母中高效表达，经过纯化，收获达98%的重组血管生成抑制素；重组血管生成抑制素具有抑制CAM血管生成和诱发血管内皮细胞凋亡的活性；重组血管生成抑制素与血管瘤模型作用14 d后，瘤体血管生长抑制率为51%(P＜0.01)，血管瘤增殖抑制率为39%(P＜0.05)。结论成功制备重组血管生成抑制素药物，血管生成抑制素对于血管瘤模型具有显著的药效。

血管生成抑制素；治疗；血管瘤；效果

血管瘤是以内皮细胞增生为特征的肿瘤，是新生儿的常见病与多发病[1]。血管瘤以体表多见，也常生长于体内脏器。血管瘤造成美容缺陷，也可导致功能障碍。血管瘤可有恶性进程特点，可出现诸多的并发症，如溃烂、出血、感染等；生长在体内的血管瘤压迫周围组织，影响脏器功能，如眶内血管瘤影响视力[2]，纵隔或肺部血管瘤影响压迫气道，肝脏或腹腔多发血管瘤造成脏器受压[3]。虽然，部分血管瘤可自行衰退，但是，由于存在着不能自行衰退的危险，不仅是那些对身体机能造成危害的血管瘤，即使是那些位于不可能产生功能损害的部位以及慢生长的血管瘤的患者的家长都会选择治疗血管瘤。虽然目前有多种治疗血管瘤的措施，例如手术、冷冻、激光、放射、硬化剂、物理、激素等，但是仍存在着美容效果不理想、并发症比例高、副作用大或是不适合于治疗体内血管瘤等问题[1]，尚有待于寻找高效安全的治疗血管瘤的药物。

血管生成抑制因子是具有抑制血管内皮细胞增殖的蛋白质。血管生成抑制因子对血管的抑制作用特异性高，在抗人癌的临床试验证明不产生毒性和抗药性[4]。而血管生成抑制素是一种重要的血管生成抑制因子，相当于纤溶酶原的K1-4功能区。前期的研究证明该蛋白具有抑制肿瘤血管增殖而达到抗癌的效果[5]。根据血管瘤的本质是毛细血管的异常增生，本文应用血管生成抑制素治疗血管瘤，以探讨其治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 重组了血管生成抑制素基因的毕赤酵母工程菌由中山大学罗进贤教授实验室提供(其工程菌的特征是用毕赤酵母的磷酸甘油醛脱氢酶启动子调控基因，磷酸甘油醛脱氢酶启动子是组成型强启动子[6])。人纤溶酶原抗血清和G418为Sigma公司产品，二抗为上海生物制品研究所产品，阳离子交换SP-Sepharose Fast Flow为Sweden产品，公鸡由海南省文昌养鸡场提供，人脐带静脉细胞购自中山大学细胞中心。

1.2 方法

1.2.1 重组蛋白的表达 参照Invitrogen公司提供的实验操作手册[7]。

1.2.2 重组蛋白的纯化 采用阳离子交换层析纯化重组蛋白。根据蛋白的氨基酸序列分别计算其等电点，配制相应pH值的磷酸氢二钠和柠檬酸溶液，用于SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱的平衡和洗脱。洗脱分三个步骤进行，分别对应0.3 mol/L、0.6 mol/L和1 mol/L浓度的Na+离子交换。过柱之后的洗脱液进行SDS-PAGE确认目标蛋白是否被洗脱以及洗脱时所用Na+的浓度。蛋白纯度分析参考文献[8]。

1.2.3 抑制鸡胚容貌尿囊膜血管生成试验 参考文献[8]的方法。

1.2.4 诱发血管内皮细胞凋亡试验 参考文献[8]的方法。

1.2.5 血管瘤模型中用药 公鸡肉垂是天然的血管瘤模型。将雄性2个月龄的10只公鸡分为两组，一组为实验组，另一组为对照组，每组5只。在实验组公鸡的右侧肉垂注射血管生成抑制素，其药物用量为5µg/只肉垂，对照组公鸡右侧肉垂注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。每2 d用药一次，共维持用药2个星期。在用药期间观察记录公鸡的体重和肉垂的增殖。计算受试肉垂的生长抑制率。在用药两星期后切下其右侧肉垂进行组织切片染色，计数组织切片中血管的数量。计算受试肉垂中血管减少率。

1.3 观察指标与评价方法 本文采用肉垂增殖差异性、体重差异性和血管数量差异性等数据对药物有效性进行评价，上述数据来源为每一只试验动物试验前后的肉垂增殖长度差值、体重差值和血管数量差值。血管瘤生长抑制率=(1-实验组给药前后平均血管瘤长度差/对照组给药前后平均血管瘤模型长度差)×100%；血管增长抑制率=(1-实验组血管瘤中血管平均数/对照组血管瘤中血管的平均数)×100%[9]。

1.4 统计学方法 采用SPSS Statistics 17.0数据处理软件对测试数据进行分析。在分析两组间的肉垂增殖差异性、体重差异性和血管数量差异性时均先进行正态性检验，并以均数±标准差(±s)的方式表示，再采用配对t检验对两组的测试数据进行分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组血管生成抑制素 将构建的含血管生成抑制素基因的毕赤酵母工程菌接种于YPD培养基中，30℃振荡培养，2 d后取样，离心取上清液走蛋白电泳(SDS-PAGE)检查基因表达情况，结果如图1所示。由图1可见，与毕赤酵母发酵液上清比较，工程菌的发酵液上清出现符合血管生成抑制素分子量的38 kD的新的蛋白带。将经过重组蛋白纯化的血管生成抑制素(纯度达98%)进行蛋白印迹，蛋白印迹结果表明，这条新的蛋白带能与人纤溶酶原抗血清特异结合，证明这条蛋白带是重组血管生成抑制素。

图1 毕赤酵母工程菌表达重组血管生成抑制素及其蛋白印迹分析

2.2 重组血管生成抑制素对血管内皮细胞及CAM血管的作用 如图2所示，仅加bFGF的对照组的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的载样滤纸下形成血管丛(平均116条血管)，而同时加bFGF和血管生成抑制素的鸡胚CAM的载样滤纸下则形成少血管区(平均17条血管)，t检验结果表明，实验组与对照组的数量比较差异具有显著统计学意义。血管内皮细胞凋亡结果如图3所示。当血管生成抑制素与人脐静脉细胞作用24 h，PBS组的血管内皮细胞凋亡率为3.5%，而血管生成抑制素组的血管内皮细胞凋亡率为82%。血管生成抑制素组的血管内皮细胞凋亡率极其显著高于PBS组的凋亡率。以上实验结果表明，在毕赤酵母中表达的血管生成抑制素具有诱发血管内皮细胞凋亡和抑制血管生成的作用。

图2 重组血管生成抑制素抑制鸡胚CAM血管生成

图3 重组血管生成抑制素诱发血管内皮细胞凋亡

2.3 血管生成抑制素对血管瘤模型的药效 主要考察血管瘤模型的增长情况，以及血管瘤模型中血管的数量。如表1所示，在两周的治疗时间里，血管生成抑制素实验组的血管瘤模型增殖显著慢于对照组(P＜0.05)，瘤模型增长抑制率为39%。如图4和图5所示，血管生成抑制素治疗组的血管瘤模型中的血管数量极其明显少于PBS对照组的血管数量(P＜0.01)，血管增殖抑制率为51%。表2为受试公鸡实验前后的体重变化，统计学分析结果表明两组的体重增加差异无统计学意义。以上结果表明，血管生成抑制素具有抑制血管瘤的血管增殖以及抑制血管瘤发展的显著效果。

表1 给药前后血管瘤模型长度变化比较(±s，cm)

表1 给药前后血管瘤模型长度变化比较(±s，cm)

实验组对照组1.38±0.36 1.34±0.23 2.10±0.49 2.52±0.18 0.72±0.38 1.18±0.19 0.023

表2 受试公鸡的体重变化比较(±s，g)

表2 受试公鸡的体重变化比较(±s，g)

实验组对照组350±47 420±48 625±73 745±60 275±31 325±47 0.103

图4 受试公鸡肉垂组织切片（40×）

图5 实验后血管瘤中的平均血管数量

3 讨论

在荷瘤的机体中能检测到血管生成抑制素，但是含量甚微，因此，重组表达是获得血管生成抑制素的主要途径。毕赤酵母是广泛应用于表达外源蛋白的菌株，已经报道应用毕赤酵母的AOX1表达系统表达几百种外源蛋白。其缺陷在于AOX1表达系统在调控外源蛋白表达时需要甲醇作为诱导剂，而甲醇是毒性易挥发物质。而后，在毕赤酵母中发现了GAP启动子，GAP启动子是组成型强启动子。由于GAP启动子不需要甲醇等毒性物质作为碳源，在重组药物的制备中更为安全[6]。本文成功地实现用毕赤酵母的GAP启动子调控表达血管生成抑制素，并经纯化获得纯度高的血管生成抑制素蛋白，建立了安全高效的生产重组血管生成抑制素的方法。

研究血管生成抑制因子治疗肿瘤已经有二十几年的历程，其作用机理是通过抑制肿瘤诱发的血管的增殖，切断肿瘤的营养供给，通过饿死肿瘤而达到治疗目的。可见，血管生成抑制因子对于肿瘤的作用是间接的，而血管瘤本身是由血管的异常增生而构成，血管生成抑制因子对于血管瘤的作用是直接的作用，直接作用的疗效应该优于间接作用的疗效。鸡冠及肉垂的真皮内，尤其是其浅层内有许多管腔扩大了的毛细血管网。电镜下可见连续性内皮及基膜，毛细血管之间有较多的成纤维细胞及胶原原纤维，这样的鸡冠结构与人的血管瘤十分类似，是良好的天然的血管瘤模型[10]。自从Ritter首次研究和应用来亨鸡的鸡冠和肉垂作为血管瘤模型进行治疗研究以来[10]，国内外陆续有关于以公鸡的鸡冠和肉垂作为血管瘤模型而应用于血管瘤的治疗研究[11-12]。应用公鸡肉垂这一天然的血管瘤模型，本文研究血管生成抑制素对于血管瘤的治疗作用，证明血管生成抑制素能够通过抑制血管瘤中血管的增殖而抑制血管瘤的发展，并且对于机体的生长发育没有影响，这些结果体现了血管生成抑制素具有开发作为安全高效的治疗血管瘤药物的前景。在接下来的研究中，我们将以与人同为灵长类的猴子为载体，将人的血管瘤移植于猴子，作为人的血管瘤模型，深入研究血管生成抑制素治疗人血管瘤的效果。为开发血管生成抑制因子作为治疗血管瘤药物提供进一步的依据。

[1]Mabeta P,Pepper MS.Hemangiomas-current therapeutic strategies [J].Int J Dev Biol,2011,55(4-5):431-437.

[2]Arora V,Prat MC,Kazim M.Acute presentation of cavernous hemangioma of the orbit[J].Orbit,2011,30(4):195-197.

[3]Papafragkakis H,Moehlen M,Garcia-Buitrago MT,et al.A case of a ruptured sclerosing liver hemangioma[J].Int J Hepatol,2011,11: 55-60.

[4]Eskens FA.Angiogenesis inhibitors in clinical development,where are we now and where are we going?[J].Br J Cancer,2004,90(1): 1-7.

[5]Kim HS,Jeong HY,Lee YK,et al.Synergistic antitumoral effect of IL-12 gene gcotransfected with antianiogenic genes forangiostatin, endostatin,and saxatilin[J].Oncol Res,2014,21(4):209-216.

[6]Zhang AL,Luo JX,Zhang TY,et al.Recent advances on GAP promoter derived expression system of Pichia pastoris.Mol Biol Rep [J].Mol Biol Rep,2009,36(1):1611-1619.

[7]Invitrogen Corp,San Diego.A manual of methods of expression of re-combinant proteins in Pichia pastoris[J].Article First Published Online,2008,31:421-423.

[8]Su DX,Zhang AL,Yi GH,et al.Inducible expression of calreticulin-N58 in Pichia pastoris by high density cell culture[J].Mol Biol Rep,2011,38(8):5003-5008.

[9]杜阳峰.核素标记不同性质单抗联合苏拉非尼治疗肝癌的动物实验研究[D].南方医科大学,2008.

[10]Ritter EJ,Goldman L,Richfield D,et al.The chicken comb and wattle as experimental model for investigative argon laser therapy of hemangiomas[J].Acta Derm Venereol,1969,49(3):304-308.

[11]Hoffman WL,Anvari B,Said S,et al.Cryogen spray cooling during Nd:YAG laser treatment of hemangiomas.A preliminary animal model study[J].Dermatol Surg,1997,23(8):635-641.

[12]Ma K,Chen SH,Liu QF,et al.Effect of high frequency electrocoagulation by ultrafine-needle on the cutaneous capillary hemangiomas:a preliminary study on cock combs[J].Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi,2010,26(6):430-434.

Study on treating angeioma by angiostatin.

FU Ce-yi1,ZHANG Ze-hua2,ZHANG Ai-lian2,LUO Jin-xian3.1.Hainan Provincial Institute For Drug and Food Control,Haikou 570216,Hainan,CHINA;2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops,Ministry of Agriculture,Haikou 571101,Hainan,CHINA;3.Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275, Guangdong,CHINA

Objective To observe the effect of using angiostatin to treat angeioma.MethodsRecombinant angiostatin was constitutively expressed in Pichia pastoris by fermentation and then purified by SP-Sepharose Fast Flow(cation exchanger).Biological activity of the recombinant angiostatin was analyzed by the tests of suppression angiogenesis of chorioallantoic membrane of chick embry(CAM)and inducing apoptosis of vascular endothelial cells.The drug effect for angeioma was analyzed after injecting recombinant angiostatin into the angeioma model (cock wattle).ResultsAngiostatin showed high-efficiency expression in Pichia pastoris and 98%of recombinant angiostatin had been obtained after the purification.The recombinant angiostatin had activity on suppressing of angiogenesis on CAM and inducing of vascular endothelial cells apoptosis.It's 51%(P＜0.01)of the inhibition rate of vascular growth in the angeioma model and 39%(P＜0.05)of the inhibition rate of proliferation of the hemangioma model after 14 days of maintenance therapy.ConclusionDrug of recombinant angiostatin had been successfully prepared.Angiostatin possesses prominent effect on the treatment of angeioma.

Angiostatin;Treatment;Angeioma;Effect

R732.2

A

1003—6350（2015）08—1111—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0398

2014-10-24)

海南省重点科技计划项目（编号：05204）

符策奕。E-mail：zhangailian6@163.com