黄维，陈洁仪，黄俊勇，周成宇

（佛山市顺德区第一人民医院肿瘤科，广东佛山528000）

TRPM8调控EMT促进人肾癌细胞A498迁移及侵袭的作用研究

黄维，陈洁仪，黄俊勇，周成宇

（佛山市顺德区第一人民医院肿瘤科，广东佛山528000）

目的探讨瞬时受体电位M8(TRPM8)是否通过上皮-间充质转化(EMT)影响人肾癌细胞的侵袭及迁移能力。方法利用荧光定量PCR来检测人肾癌细胞A498、786-0以及GRC-1中TRPM8的表达水平；设计并合成靶向TRPM8的特异性shRNA，通过脂质体转染法转染TRPM8表达最高的肾癌细胞A498以构建稳定低表达TRPM8细胞株，通过Western blot和定量PCR来验证shRNA的干扰效率；通过Transwell法检测干扰后细胞的迁移及侵袭能力，Western blot法检测EMT相关指标E-cadherin和N-cadherin以及其上游信号分子Snail和WNT-5a的变化。结果TRPM8-shRNA转染后，能够有效抑制A498细胞中TRPM8的表达；Transwell法检测细胞侵袭能力结果显示，A498组、Control组和shRNA组的穿膜细胞数分别为(102.56±11.41)、(105.67±10.83)、(74.62±8.65)，A498/shRNA组细胞侵袭能力受到显著抑制(F=49.105，P＜0.01)；Transwell法检测细胞迁移能力结果显示，A498组、Control组和shRNA组的穿膜细胞数分别为(115.45±10.31)、(109.33±7.53)、(76.21±13.28)，A498/ shRNA组细胞迁移能力受到显著抑制（F=36.168，P＜0.01）；Western blot法结果发现，TRPM8干扰组细胞的E-cadherin表达增加，N-cadherin的表达降低；此外，TRPM8干扰组细胞的Snail以及WNT-5a表达较对照组显著下降。结论运用RNA干扰技术能够有效沉默A498细胞的TRPM8基因，并诱导其迁移侵袭能力的下降，其可能的机制是通过调节EMT的上游信号分子Snail、WNT-5a的表达来调控EMT，从而影响肾癌细胞的迁移及侵袭。以上提示TRPM8在肾癌的发生发展中起重要作用，抑制TRPM8的表达可能成为一种治疗肾癌的新方法。

TRPM8；肾癌；侵袭；迁移

肾癌(Renal carcinoma)是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，其中大部分是肾细胞癌(Renal cell carcinoma)，目前肾癌有逐年增加的趋势，且早期诊断较为困难，相当一部分患者在就诊时已处于中晚期，临床上主要以手术治疗为主，但往往疗效不佳[1-2]。因此，迫切需要寻找新的方法提高肾癌患者的生存期。随着分子生物学的飞速发展，分子靶向治疗已成为当今肾癌防治研究的热点，目前应用于临床的有索拉非尼及舒尼替尼[3]。瞬时受体电位8(TRPM8)是瞬时受体电位(Transient receptor potential，TRP)家族中的一员，可通过介导钙离子内流参与多种生理及病理过程。已有研究表明其与多种肿瘤发生发展密切相关[4]。此外，上皮细胞-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤转移中也发挥了重要作用[5]。本研究拟利用特异性shRNA转染肾癌离体细胞株A498以构建TRPM8低表达的稳定细胞株，观察TRPM8基因下调后对A498迁移及侵袭的影响以及EMT相关指标的表达变化，初步探讨TRPM8基因在肾癌细胞中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人肾癌细胞A498、786-0以及GRC-1购自于中科院上海细胞库。四株细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640中，并置于5%二氧化碳以及37℃细胞培养箱内培养。

1.2 TRPM8特异性shRNA和转染TRPM8 shRNA购自美国Santa Cruz公司(Cat.sc-95009-SH)。采用脂质体转染技术，具体操作流程参照英韦创津公司的Lipofectamine2000产品说明书。48 h后加入筛选抗生素G418，浓度为400 μg/ml，维持培养6 d后G418浓度改为200 μg/ml；细胞扩增后提取蛋白和RNA，进行RT-PCR和Western blot鉴定。

1.3 荧光定量PCR采用TGuide RNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取RNA。逆转录反应则采用TAKARA的PrimeScript™II Reverse Transcriptase试剂盒。引物序列如下:TRPM8正义链：5'-TATCTTACTGAACACCTGTAGTCCCAG-3'，TRPM8反义链：5'-TGAGTTTATAGTGTATTCAAAGCTGAGAA-3' (256bp)；GAPDH正义链：5'-AGGTGAAGGTCGGAGT CAAC-3'，GAPDH反义链：5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'(232bp)。实验重复3次。

1.4 Western blot将约1×107个细胞加至蛋白裂解液，冰上静置30 min，低温离心20 min(转速12 000 r/min)，提取上清。应用BCA定量法计算蛋白的浓度。取60 μg总蛋白跑胶(恒压100 V)。电转膜30 min。含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h。一抗4℃冰箱过夜，二抗孵育1 h后显影。TRPM8、E-cadherin、N-cadherin、WNT-5a、Snail以及GAPDH抗体均购自美国Santa cruz公司。

1.5 Transwell法检测细胞的迁移能力首先将Transwell小室放进24孔板里，然后将稳定转染TRPM8或阴性对照序列的细胞用胰蛋白酶消化，用不含胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤细胞3次，随之将细胞重悬，每孔加入100 μl细胞悬液，在小室的下层加入500 μl 1%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在培养箱中放置24 h。最后取出小室，弃掉培养基，使用棉签轻轻擦去小室内的残余细胞。甲醛固定并结晶紫染色。显微镜下观察，随机选取8个视野进行细胞计数。

1.6 Transwell法检测细胞的侵袭能力方法同上，但与迁移实验有所区别的是，在上室的聚碳酸酯膜之上还要铺上一层基质胶，用以模拟体内ECM，细胞进入下室之前，必须先将基质胶降解。随机选取8个视野进行细胞计数。

1.7 统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。Transwell侵袭实验采用析因设计方差分析比较各组间差异；荧光定量PCR实验采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组间差异。以P＜0.05界定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌细胞中TRPM8的表达四株肾癌细胞中，A498的TRPM8表达水平最高(以此为参照)，而786-0以及GRC-1细胞的相对表达水平分别为(0.35±0.06)和(0.64±0.05)。故选择A498作为研究对象以作下一步实验，见图1。

图1 TRPM8 mRNA在3株肾癌细胞中的表达水平

2.2 shRNA抑制A498细胞中TRPM8的表达A498细胞经特异性shRNA转染筛选后，Western blot和荧光定量PCR结果显示TRPM8的蛋白水平及核酸水平表达均较对照组显著下调(F=103.65，P＜0.01)，提示TRPM8表达下调的A498细胞株构建成功，命名为A498/shRNA，并用于下一步实验，见图2。

图2 shRNA显著抑制A498细胞的TRPM8表达

2.3 TRPM8基因沉默后A498细胞的迁移能力变化研究结果提示：A498组、对照组(A498/Con)组和A498/shRNA组的穿膜细胞数分别为(115.45± 10.31)、(109.33±7.53)、(76.21±13.28)。与对照组比较，A498/shRNA组细胞迁移能力受到显著抑制(F= 36.168，P＜0.01)，见图3。

图3 TRPM8对细胞体外迁移能力的影响：上图为显微镜下各组细的观察；下图为各组中侵袭细胞的数目比较

2.4 TRPM8下调后A498细胞的侵袭能力变化研究结果提示(图4)，A498组、对照组(A498/ Con)组和A498/shRNA组的穿膜细胞数分别为(102.56±11.41)、(105.67±10.83)、(74.62±8.65)。与对照组比较，A498/shRNA组细胞侵袭能力受到显著抑制(F=49.105，P＜0.01)。

图4 TRPM8对细胞体外侵袭能力的影响：上图为显微镜下各组细胞的观察；下图为各组中侵袭细胞的数目比较

2.5 TRPM8基因沉默后A498细胞的E-cadherin、N-cadherin、Snail以及WNT-5a表达情况通过Westen blot检测发现(图5)，A498/shRNA组的E-cadherin表达显著增加，而N-cadherin的表达显著降低；此外，TRPM8干扰组细胞的Snail、WNT-5a表达较对照组显著下降。结果提示TRPM8可能通过调节Snail和WNT-5a两种上游信号因子来调控EMT的发生。

图5 TRPM8基因敲除对A498细胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail以及WNT-5a表达的影响

3 讨论

肾癌与前列腺癌和膀胱癌并称泌尿系统三大恶性肿瘤，占所有男性恶性肿瘤的3%。据流行病学报告，在美国每年将会新发31 500例肾癌病例[2]。我国目前虽无准确的发病统计，但据20世纪90年代我国居民死因构成统计，肾肿瘤的死亡率约为0.32/10万人[6]。有研究表明细胞内钙离子水平与肿瘤细胞恶性程度密切相关，TRP可通过介导钙离子内流来调节肿瘤细胞的生物学行为，TRPM8作为TRP家族中的一员，已被证实在前列腺癌、舌癌及肝癌等多种肿瘤中高表达，并与预后密切相关目前研究已证实[7-11]。本研究结果表明，在肾癌中TRPM8是高表达的；成功构建TRPM8低表达的细胞株后，发现该组细胞的迁移及侵袭能力较对照组显著下降。因此，我们推测TRPM8基因是肾癌的促转移相关基因。

EMT作为上皮源性肿瘤发生发展过程中的重要步骤，与肿瘤浸润及转移密切相关，其主要特征为上皮标志物E-cadherin表达的减少，间质标志物N-cadherin表达的增加[12-13]。Snail是E-cadherin的主要调节因子，可通过与Smad相互作用蛋白(SIP1)竞争性结合E-cadherin蛋白启动子区的E-box连接基序，抑制E-cadherin的表达，从而诱导EMT发生[14]。已有研究表明，Snail的表达在转录和转录后水平受到PI3K/ AKT通路的直接调控，而TRPM8能直接活化PI3K/ AKT通路[15-16]。因此，我们推测TRPM8是否通过调节Snail来调控E-cadherin的表达水平，从而推动EMT的发生。

我们进一步研究结果显示，肾癌细胞在TRPM8下调后，Snail分子的表达水平较对照组显著降低，而E-cadherin表达显著增加，N-cadherin表达则显著下降，提示了TRPM8与肾癌细胞EMT密切相关，其部分机制可能为TRPM8通过对Snail因子的调控，从而影响E-cadherin的表达水平。然而，值得注意的是，EMT的调节涉及多条信号通路，且这些信号通路之间可能还存在着相互作用(Cross-over)。WNT通路是目前研究得比较深入的与EMT密切相关的信号通路[17]。为了进一步明确TRPM8对EMT的调节作用，我们还检测了WNT通路的关键调节因子WNT-5a的表达，发现TRPM8下调后，WNT-5a蛋白表达亦受到明显抑制，这提示了TRPM8对EMT的调控可能也与WNT通路相关。

综上所述，本研究探讨了TRPM8与EMT及肾癌细胞迁移侵袭之间的相互关系，发现TRPM8可通过调控EMT的发生影响肾癌细胞的迁移及侵袭，其可能机制为调节EMT上游通路分子Snail及WNT-5a。这为进一步揭示TRPM8基因与肾癌的关系提供新的实验依据，为探讨肾癌转移的分子机制提供新的思路。

[1]Albiges L,Choueiri T,Escudier B,et al.A systematic review of sequencing and combinations of systemic therapy in metastatic renal cancer[J].Eur Urol,2014,22(1):243-248.

[2]Ridge CA,Pua BB,Madoff DC.Epidemiology and staging of renal cell carcinoma[J].Semin Intervent Radiol,2014,31(1):3-8.

[3]Kanesvaran R,Tan MH.Targeted therapy for renal cell carcinoma: The next lap[J].J Carcinog,2014,13(1):341-345.

[4]Han H,Yi F.New insights into TRP channels:Interaction with pattern recognition receptors[J].Channels(Austin),2013,8(1): 671-673.

[5]Lamouille S,Xu J,Derynck R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(3): 178-196.

[6]赵振威,李延江.肾细胞癌流行病学的研究进展[J].山东医药, 2013,7(1):95-97.

[7]Defalco J,Duncton MA,Emerling D.TRPM8 biology and medicinal chemistry[J].Curr Top Med Chem,2011,11(17):2237-2252.

[8]Voets T,Owsianik G,Nilius B.TRPM8[J].Handb Exp Pharmacol, 2007,15(179):329-344.

[9]Zhang L,Barritt GJ.TRPM8 in prostate cancer cells:a potential diagnostic and prognostic marker with a secretory function?[J]. Endocr Relat Cancer,2006,13(1):27-38.

[10]潘娴,吴煜农,傅振,等.TRPM8在舌癌组织及Tca8113中的表达及其意义[J].口腔生物医学,2010,3(1):120-123.

[11]刘杰锋.TRPM8在原发性肝细胞癌组织中的表达及临床意义[D].中南大学,2010.

[12]Tsai JH,Yang J.Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis[J].Genes Dev,2013,27(20):2192-2206.

[13]Schramm HM.Should EMT of cancer cells be understood as epithelial-myeloid transition?[J].J Cancer,2014,5(2):125-132.

[14]Gheldof A,Berx G.Cadherins and epithelial-to-mesenchymal transition[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2013,116(1):317-336.

[15]Wu Y,Zhou BP.Snail:More than EMT[J].Cell Adh Migr,2010,4 (2):199-203.

[16]Riaz A,Ilan N,Vlodavsky I,et al.Characterization of heparanase-induced phosphatidylinositol 3-kinase-AKT activation and its integrin dependence[J].J Biol Chem,2013,288(17):12366-12375.

[17]Ramani VC,Purushothaman A,Stewart MD,et al.The heparanase/ syndecan-1 axis in cancer:mechanisms and therapies[J].FEBS J, 2013,280(10):2294-2306.

Down-regulation of TRPM8 suppresses invasion and migration of human renal carcinoma cell A498 via inhibiting EMT.

HUANG Wei,CHEN Jie-yi,HUANG Jun-yong,ZHOU Cheng-yu.Department of Oncology,the First People’s Hospital of Shunde District of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of down-regulation of TRPM8 on the invasion and migration of renal carcinoma cells A498.MethodsThe expression of TRPM8 in human renal carcinoma cell A498,786-0 and GRC-1 were detected by fluorescence quantitative PCR.shRNA targeting TRPM8 was designed and synthesized,and then transfected into the A498 cells via Lipofectamine 2000 mediation.The interference efficiency of shRNA was evaluated by Western blot and quantitative PCR.The migration ability and invasion ability of A498 were detected by using transwell assay.Expression of E-cadherin,N-cadherin,WNT-5a and Snail were detected by using Western blot.ResultsTRPM8-targeted shRNA could down-regulate the TRPM8 expression of A498.Transwell Cell number of invasion was(102.56±11.41),(105.67±10.83),(74.62±8.65)in A498 group,control group and shRNA group,respectively,which indicated that cell invasion ability were significantly inhibited in shRNA group(F=49.105, P＜0.01).Transwell Cell number of migration was(115.45±10.31),(109.33±7.53),(76.21±13.28)in A498 group,control group and shRNA group,respectively,which indicated that cell migration ability were significantly inhibited in shRNA group(F=36.168,P＜0.01).In addition,the expression of E-cadherin was increased,while that of N-cadherin, WNT-5a and Snail was decreased in shRNA interference group.ConclusionDown-regulation of TRPM8 can induce inhibition of invasion and migration in human renal carcinoma cells A498 via regulating epithelial mesenchymal transitions(EMT),specifically,the upstream signal molecule Snail,WNT-5a of EMT.It could be regarded as a novel target for clinical diagnosis and gene therapy for renal carcinoma.

TRPM8;Renal carcinoma;Invasion;Migration

R737.11

A

1003—6350（2015）01—0018—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0006

2014-06-29)

黄维。E-mail：12258276@qq.com