林茂虎，朱晓应，苗 芮，何 蕾，贾 宁

1解放军总医院第一附属医院 泌尿外科，北京 100051；2解放军总医院 肝胆外科，北京 100853；3解放军总医院 感染管理与疾病控制科，北京 100853

近年来，医院和社区内鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii，Ab)感染呈快速增长的趋势，在美国、法国、西班牙、比利时、英国、韩国等均有医院内大规模暴发[1-4]的报道，给病人和医院造成了很大经济损失；尽管目前国内外关于医院和社区内鲍曼不动杆菌暴发和流行的报道很多，但造成该菌流行的原因尚不明确。TOLL样受体(tolllike receptors，TLRs)被认为是最重要的模式识别受体，是IL-1R超家族的成员之一，可见于单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中，参与细菌和病毒的感染介导和调控。目前所知TLR家族成员有11种，为了探讨鲍曼不动杆菌感染和TOLL样受体成员TLR-2、TLR-4的相关性，为鲍曼不动杆菌感染的早期预防提供依据，进行如下研究。

材料和方法

1 入选病例 经解放军总医院第一附属医院伦理委员会同意后，利用全国医院感染监测网收集2009年1月- 2012年12月医院内鲍曼不动杆菌的感染病例(病人发热伴白细胞、中性粒细胞升高，且痰、血液、脑脊液或尿等标本细菌培养鲍曼不动杆菌阳性)。感染病人423例作为试验组；选择同一病房与病例性别相同、年龄相差不超过2岁但未感染病人385例作为对照组，记录两组患者年龄、性别等临床资料。为了减少人群分层因素的干扰，本研究选择的患者均为中国汉族。

2 标本收集 收集感染病人痰、血液、脑脊液或尿标本，按常规方法分离鉴定并-80℃保存，分离自同一病例的菌株入选首次分离的菌株；采集每例患者外周EDTA抗凝全血3 ml，按照DNA提取试剂盒说明，提取每例基因组DNA约150 mg，-80℃保存。

3 单核苷酸多态性检测 根据http：//innateimmunity. net网站公布的SNPs数据库，编码序列同义或非同义突变、频率＞5%的SNPs位点，以及文献报道的与细菌感染相关SNPs位点作为候选SNPs位点。选 择TLR-2(rs3804099，rs7656411和rs76112010)和TLR-4(rs1927914和rs10759932和rs11536889)位点，根据各基因多态性位点设计引物，采用iMLDR SNP分型技术(上海天昊专利技术)进行单核苷酸多态性检测。

4 遗传特性分析 应用SNPalyze V4.0软件(DYNACOM，Kanagawa，Japan)，分别在两组患者中对上述候选基因变异型进行最小等位基因频率、杂合性、哈迪-温伯格平衡和连锁不平衡等遗传特性的分析。应用χ2-检验，检测所有SNP是否遵守哈迪-温伯格平衡；应用r2数值评价任意两个SNP之间的成对连锁不平衡；应用最大期望预测法则，估计每个个体的二倍体性。

5 候选基因SNPs与鲍曼不动杆菌感染相关性分析 采用SPSS10.0软件进行单因素分析估计各基因型与鲍曼不动杆菌感染的相关性，然后将是否发病作为因变量，单因素分析中有统计学意义的变量作为自变量，进行多元Logistic回归分析，筛选出与感染有关联的基因SNP位点。

结 果

1 患者临床资料 在423例鲍曼不动杆菌感染病人和385例对照人群中，鲍曼不动杆菌感染与性别无统计学差异(P=0.98)，但是t检验显示鲍曼不动杆菌感染与年龄增加相关(P=8.6×10-6)，因而接下来的遗传分析以年龄做校正。

2 基因分型 在感染组和对照组中，采用iMLDR SNP分型技术对6个SNPs位点[TLR-2(rs3804099，rs7656411和 rs76112010)，TLR-4(rs1927914，rs10759932和rs11536889)]进行基因分型，选出的检测位点的最小等位基因频率见表1。所有SNP符合哈迪-温伯格平衡。TLR2和TLR4基因多态性与鲍曼不动杆菌感染的相关性见表2，提示所检测的6个SNPs位点的频率在病例组和对照组间无统计学差异。TLR-2，TLR-4的单倍体型分型见表3，其中TLR-4单倍体型GCG与鲍曼不动杆菌感染的相关性有统计学意义(P=0.027)；其余TLR2和TLR4单倍体在实验组和对照组的分布无统计学差异。与TLR-4常见单倍型ATG不同，单倍型GCG包含两个突变点，且均位于启动子区域(表1)。

讨 论

感染的发生、发展是病原体致病性与宿主相互作用的结果。越来越多的研究表明，TLRs的单核苷酸多态性与人体对疾病的易感性关系密切。TLR2与TLR1、TLR6结合成异源二聚体，其编码的784个氨基酸的89.8 kU蛋白，可与细菌的配体如脂肽、肽聚糖、G+菌的脂膜酸等相互作用[5-6]。TLR2的变异型(G2477A/Arg753Gln)在人群中发生率为2.7% ~ 9.4%，与哮喘、过敏性皮炎、结核杆菌、葡萄球菌、假丝酵母菌感染的易感性相关[7-9]。TLR4可形成同源二聚体，其编码的839个氨基酸95.6 kU蛋白，除了可识别一些G+细菌的热休克蛋白、纤毛、逆转录病毒的包膜糖蛋白、分枝杆菌的不耐热成分、螺旋体的胞壁酸等[5,10]，其在识别大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟球菌、沙门菌、嗜肺性军团菌等的LPS，且介导信号转导中的作用已比较明确[11]。TLR4常见的SNPs(A1287G/Asp299Gly， C13174T/Thr399Ile)可影响受体的细胞外结构，导致TLR4对吸入的LPS反应迟缓，增加感染性休克的发生率；此多态性还与严重呼吸道合胞病毒支气管炎的发生密切相关[5,8,12]；而另两个常见变异型(A896G和C1196T)则对人群感染嗜肺性军团菌有保护作用[13-14]。

表1 TLR2, TLR4基因单核苷酸多态性特点Tab. 1 Characteristics of the studied SNPs in TLR2, TLR4 genes

表2 TLR2, TLR4单核苷酸多态性与鲍曼不动杆菌感染相关性分析Tab. 2 Association of TLR2, TLR4 gene polymorphisms with Ab infection by logistic regression analysis (n, %)

表3 鲍曼不动杆菌感染病人和对照组TLR-2和TLR-4基因单核苷酸多态性单倍型分布Tab. 3 Haplotype distribution of TLR-2, TLR-4 polymorphisms in Ab infected patients and controls

本研究对TLR2和TLR4基因6个候选位点的SNP的多态性检测中，TLR-4单倍体型GCG与鲍曼不动杆菌感染的相关性有统计学意义(P=0.027)；其余TLR2和TLR4单倍体在实验组和对照组的分布无统计学差异。与TLR-4常见单倍型ATG不同，单倍型GCG包含两个突变点，且均位于启动子区域，我们推测位于TLR-4启动子的两个SNPs(rs1927914和rs10759932)的可能会影响转录调控，与鲍曼不动杆菌感染有相关性，证实在鲍曼不动杆菌感染中宿主因素不容忽视，但对于其如何调控还需进一步实验研究探讨。

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