尚永刚，韩广玮，董小小，崔 栋，刘城城，易善红 (.第三军医大学新桥医院泌尿外科，重庆400037;.第三军医大学新桥医院超声诊断科，重庆400037)

慢性前列腺炎是最常见的前列腺疾病［1］，流行病学调查显示，约30% ～40% 的中青年男性患有此病［2］。临床上多以尿路刺激征、会阴部及下腰部疼痛不适等为主要表现［3］，并多伴有焦虑、抑郁等精神症状［4］，严重危害着患者的身心健康。临床上有多种方法治疗慢性前列腺炎，但效果欠佳，治疗后容易复发［5］。近年来的研究表明，“血－前列腺屏障”的存在是限制慢性前列腺炎治疗效果的重要因素［6］，如何开放“血－前列腺屏障”，提高前列腺组织的通透性是近年来研究的热点。在前期的研究中，我们观察到微泡介导下低频超声辐照可以显著提高动物前列腺组织的通透性［7］，该方法可能成为治疗慢性前列腺炎的一种新方法。但是，超声微泡作用是否能提高前列腺组织中的药物浓度，尚未明确。因此，我们通过实验观察微泡介导下低频超声辐照对前列腺组织中药物浓度的影响，以寻求治疗慢性前列腺炎的新方法。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

头孢呋辛钠标准品0.5 g(中国药品生物制品检定所);注射用头孢呋辛钠粉针0.75 mg(意大利EssetiFarmaceuticis.r.l);造影剂微泡(脂氟显，第三军医大学附属新桥医院超声科自行研制);0.9%氯化钠注射液500 mL(四川科伦药业公司);15%三氯乙酸(成都市科隆化工试剂公司);3%戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 实验仪器

低功率超声治疗仪(第三军医大学附属新桥医院超声科自行研制);美国Waters 高效液相色谱仪;高速离心机(贝克曼Allegra 64R)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组 选取200 ～300 mg 的成年雄性SD 大鼠20 只(购自第三军医大学大坪医院实验动物中心)，采用抽签法随机分为实验组(超声微泡+头孢呋辛组)及对照组(头孢呋辛组)，每组10 只。

1.3.2 标本收集 在实验组中，沿下腹部正中切口暴露前列腺后将配置好的头孢呋辛钠溶液(60 mg/kg)与造影剂微泡(0.1 mL/kg)经尾静脉同时注入大鼠体内，随后立即给予超声治疗仪持续辐照前列腺5 min(频率1.0 MHz，声压250 kPa，占空比1%，声压0.023 W/cm2)。同样方法暴露对照组大鼠前列腺，经尾静脉同时注射头孢呋辛钠溶液(60 mg/kg)与生理盐水(0.1 mL/kg)，随后给予超声假照5 min(不发射超声波)。辐照结束后立即取出前列腺组织，置于－80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.3 样品的制备 将前列腺组织置于室温下避光解冻，用生理盐水漂洗前列腺，洗净前列腺组织表面淤血，吸水纸吸干后准确称取其质量，放置于试管中，剪碎，加入生理盐水2 mL，制成组织匀浆。漩涡混匀30 s 后置于10 000 r/min 离心机中离心5 min，取上清，加入15%三氯乙酸0.4 mL 沉淀蛋白后再次离心5 min，取上清液0.4 mL 待测。

1.3.4 标准液的制备 精密称取头孢呋辛标准品50 mg 置于50 mL 容量瓶中，加入超纯水50 mL 定容，即制备成1 mg/mL的标准液。

1.3.5 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:酸钠缓冲液－ 乙腈(75 ∶25);pH:3.9;流速:1 mL/min;进液量:10 μl;检测波长:272 nm。

1.3.6 色谱行为 取空白前列腺组织，按1.3.3 中方法制备前列腺组织上清液，取上清液0.4 mL，进样10 μl，得到空白前列腺组织上清液色谱图;取1 mg/mL 头孢呋辛标准液0.4 mL，进样10 μl，得到头孢呋辛标准品色谱图;将1 mg/mL 头孢呋辛标准液与空白前列腺组织上清液均匀的混合，取10 μl 进样，得到头孢呋辛标准及前列腺上清液混合物色谱图。

1.3.7 标准曲线的绘制 依次将配置好的头孢呋辛标准液稀释为0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 及50 μg/mL的溶液，按前列腺样品液处理方法处理后进样。记录各质量浓度下的色谱峰面积，以X 轴为质量浓度，Y 轴为峰面积做图，即可得到头孢呋辛标准曲线。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 色谱行为

空白前列腺组织上清液色谱图、头孢呋辛标准品色谱图和头孢呋辛标准品和前列腺上清液混合物色谱图见图1。由图可见，前列腺组织上清液及头孢呋辛标准品的保留时间分别约为2.9 min、4.5 min，头孢呋辛色谱峰与前列腺组织杂质色谱峰完全分离，前列腺组织上清液内杂质对头孢呋辛样品定量测定干扰较小。

图1 头孢呋辛标准品与空白前列腺的HPLC 色谱图

2.2 标准曲线

以测得的各质量浓度头孢呋辛标准液色谱峰面积为纵轴，以标准液质量浓度为横轴，得到头孢呋辛标准曲线(图2)。外标法定量，采用加权最小二乘法进行回归计算。求得直线回归方程为:y=33 066x－2 515.9(R2=0.999，n=5)。

图2 头孢呋辛标准曲线

2.3 前列腺组织中头孢呋辛质量浓度测定

以高效液相色谱仪检测各样品中头孢呋辛含量，并根据样品处理前前列腺质量计算单位质量前列腺组织中所含头孢呋辛质量浓度。实验组及对照组单位质量前列腺组织中所含头孢呋辛质量浓度分别为(16.274 ±9.515)μg/mg、(8.336 ±6.743)μg/mg，与对照组比较，实验组中单位质量前列腺组织中所含头孢呋辛质量浓度明显升高(P ＜0.05)，见表1。

表1 超声微泡作用后前列腺组织中头孢呋辛质量浓度比较(μg/mg)

3 讨论

血－脑屏障、血－睾屏障目前已经通过许多实验得到了证实，而在男性泌尿生殖系统中是否也存在着相似的屏障结构呢?Motrich 等［8］通过实验证实在自身免疫性前列腺炎大鼠中，精子的损害发生在精子和前列腺液混合过程中，因此，学者们认为在前列腺组织中可能也存在一个与血－脑屏障、血－睾屏障相似的“屏障”结构，并具有阻止炎症发生和炎细胞迁移、保护精子免受损害的作用［9］。血－脑屏障限制水溶性以及大分子脂溶性物质进入脑内，起到了维持大脑内环境稳定的作用，但妨碍了大分子药物进入脑内，使脑部疾病药物治疗较为困难［10］。血－前列腺屏障有可能也存在相似的功能，限制药物进入前列腺组织。另外，前列腺组织发生慢性炎症时，导致前列腺组织发生病理改变，纤维组织增生、基底膜增厚、细胞间紧密连接更加致密加强等原因，进一步加强了这种“屏障”作用［11］。由此可以推测，进入血液的药物成分就可能受到血－前列腺屏障的限制而只有少量能到达前列腺组织内发挥作用，这正好解释了为什么大多数抗菌药物在前列腺液中浓度比较低［12］，以至于不能最大限度发挥药物疗效。因此，如何开放血－前列腺屏障成为近年来实验研究和临床治疗慢性前列腺炎的热点话题。

造影剂微泡作为一种新型的声学造影剂，既可以增强超声显像，又可以介导低频超声辐照提高局部组织的通透性，使药物在局部达到较高浓度［13］。其原理主要是在微泡介导下超声波通过其空化效应，使微血管及细胞生物膜受损，增加血管内皮细胞之间以及生物膜间的空隙，促进血液内成分溢出血管并通过生物膜到达治疗部位，总的来说，就是增加了生物屏障的通透性［14］。微泡介导下低频超声辐照开放血－脑屏障(或血－肿瘤屏障)并靶向释放药物及基因治疗神经系统疾病的研究应用较多［15-16］，已经证明有很好的临床应用价值。

在前期实验中，本课题组成员观察到经微泡介导下的低频超声辐照能显著提高渗入到动物前列腺组织中的伊文思蓝浓度，提示微泡介导下低频超声辐照提高了前列腺组织的通透性，此方法可能成为治疗慢性前列腺炎的一种新方法［7］。而本研究更直观地显示，微泡介导下低频超声辐照显著提高了动物前列腺组织中的头孢呋辛浓度，再次证实超声微泡可以显著提高前列腺组织通透性的事实，为后期超声微泡在治疗慢性前列腺炎中的应用进一步奠定了理论基础。

虽然微泡介导下低频超声辐照能显著提高前列腺组织中的药物浓度，但其具体机制仍不明确。前期研究通过透射电镜观察到经超声微泡作用后前列腺组织中毛细血管内皮细胞间的紧密连接遭到破坏，表明超声微泡作用可能通过开放紧密连接来提高前列腺组织的通透性［7］，目前关于这方面的研究较少，有进一步研究的价值。

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