徐晓菲，张雯柯，王莉，李娜，刘迎玉，李敏，张翊昕，范俊梅，姚元庆＊

（1，中国人民解放军总医院妇产科，北京 100853；2，第四军医大学唐都医院妇产科，西安 710038；3，天津南开大学医学院研究生处，天津 300071）

植入前遗传学诊断（PGD）主要指对通过体外受精（IVF）获得的胚胎在植入子宫前进行的遗传学检测，检出携带致病基因和核型异常的胚胎，选择正常胚胎植入子宫内，从而获得健康胎儿的诊断方法。PGD 是辅助生殖与遗传学诊断相结合而形成的一种孕前检测技术，为高风险生育遗传缺陷患儿的夫妇选择性植入正常胚胎，一方面阻断了遗传性疾病的垂直传播，减轻社会及家庭的负担；另一方面，避免了传统产前诊断遗传性疾病进行的治疗性流产，羊膜腔穿刺等操作对孕妇带来的身心伤害，更加适用于合并生育障碍的患者。目前，PGD 主要应用于单基因遗传病及染色体异常的检测。

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一，其死亡率在大多数国家占女性各类肿瘤首位。近年来其发病率在我国逐渐上升并呈年轻化趋势。人类乳腺 癌 易 感 基 因（breast cancer susceptibility gene 1／2，BRCA1／2）是目前已知的乳腺癌高外显率易感基因，与家族性、遗传性的乳腺癌、卵巢癌密切相关。BRCA1／2基因同为抑癌基因，主要参与DNA 损伤修复及维护基因组完整。近年来对乳腺癌、卵巢癌高发家族分析表明，约5%～10%患者的发病与易感基因相关［1-2］，其中，遗传性乳腺癌和卵巢癌患者中约有60%～75%伴有BRCA1／2基因的突变［3-5］，其突变属于常染色体不完全显性遗传［6］。研究表明，BRCA1／2基因突变的携带者发生乳腺癌和卵巢癌的终身累计风险分别达到40%～87%及16%～64%［7-10］。除此之外，近年来许多相关研究同样表明，BRCA1／2基因的突变与结肠癌、胰腺癌、前列腺癌等其他癌症的发病相关联［11］。

对BRCA1／2基因突变进行检测，寻找其致病性的突变位点，及时筛选出高危病患，有助于风险评估和早期预防。另外，因突变为常染色体遗传，杂合患者有50%的可能性将突变基因遗传给后代，如生育携带BRCA1／2 突变基因的胎儿，是否选择妊娠终止将会是家庭难以解决的问题，这一做法在许多国家无法获得法律的许可。针对突变基因携带者选择性进行第三代试管婴儿-植入前遗传学诊断（PGD）能够避免这一问题的发生，从根本上有效地阻断遗传性乳腺癌、卵巢癌的垂直传播。

一、BRCA1／2植入前遗传学诊断应用回顾

BRCA1／2基因的发现是乳腺癌临床基因筛查的一个重要转折点，自此之后，越来越多存在乳腺癌／卵巢癌家族史的妇女开始寻求基因咨询。1989年，Handyside等［12］成功运用聚合酶链反应（PCR）技术对高风险传递X-连锁隐性遗传病的夫妇成功分析了卵裂球的性别构成，并于1990年诞生了首例经PGD 的健康婴儿。随着这一技术的逐渐稳定，PGD 已逐步应用于200多种单基因遗传性疾病［13］。目前，运用PGD 方法使BRCA1／2突变携带者避免下一代高危易感基因风险的技术方法已成功建立并证实可行。在以色列、比利时、西班牙、荷兰等国家的生殖医学实验室陆续开展了遗传性乳腺癌／卵巢癌的PGD 相关研究［14-15］。相关法律法规逐渐建立并支持该研究的发展。2003 年欧洲人类生殖及胚胎学会（ESHRE）的法律及伦理工作小组放宽了PGD 指征：可以接受对于BRCA1／2基因突变一类的迟发性疾病执行PGD［16］；2006年5月，英国人类受精和胚胎学管理局（HFEA）准许PGD 应用于低外显率迟发性遗传性癌症易感疾病，例如遗传性乳腺癌卵巢癌综合征（HBOC）［17］。社会学、伦理学家对BRCA1／2 基因植入前遗传学诊断的迟发性、不完全外显率以及伦理道德等各方面问题进行了一系列 的 讨 论，2007 年，Menon 等［18］通 过 调 查52 名BRCA 基因突变携带者称，其中39人（75%）认为可以接受并支持执行PGD，赞同HFEA 的决议。

尽管越来越多的人们关注这一技术的发展，赞成其应用，到目前仅有较少数对于BRCA 基因突变携带者PGD 的报道。2008 年，澳大利亚报道了第一例行BRCA1 基因突变PGD 后出生的健康男婴［19］；2009年，Sagi等［14］对10名以色列妇女进行了植入前遗传学咨询（包括7 名无症状携带者及3名乳腺癌携带者），其中5名选择执行PGD，最终3位成功受孕。近期，荷兰Derks-Smeets等［15］报道称，对70对夫妻进行了乳腺癌易感基因的PGD，其中包括男性携带者、无症状女性携带者以及乳腺癌患者，共720个胚胎在体外受精后进行基因检测，其中294（40.7%）个胚胎不携带BRCA1 或BRCA2突变，适合移植，最终有38名健康胎儿出生。然而，两名携带BRCA1突变的妇女在PGD 后不久诊断为乳腺癌。辅助生殖-PGD 使用激素后的母体安全仍需要进一步讨论。

迄今为止，国内虽已开展了许多单基因遗传病PGD 相关实验研究，但尚未有BRCA1／2基因的临床植入前遗传学诊断的报道。

二、BRCA1／2基因突变PGD 技术

（一）遗传咨询及突变检测

希望行BRCA1／2 突变基因PGD 的夫妻大多由于家庭成员中至少一人已发生乳腺癌或卵巢癌，或夫妻双方至少有一人已检测到BRCA1／2基因突变，因此，确定BRCA1／2基因突变携带者突变位点是进一步遗传诊断的前提。同时，应尽可能对其他家庭成员进行遗传检测，以明确基因相关联的遗传标记，提高PGD 诊断准确性。

（二）活检单细胞来源

进行单基因疾病PGD 活检建议选用ICSI受精，这一过程可以避免透明带上粘附的其他精子导致的潜在污染［20］。PGD 的另一个重要环节是更加积极的卵巢刺激，通过控制性超排卵（COH）在超声引导下提取大量成熟卵泡。ESHRE 数据显示，在PGD 循环过程中，提取卵细胞的平均数量为15个［21］。Vandervorst等［22］建议，当提取卵泡数不足6个时，应适当考虑取消PGD。根据ESHRE 提示，在诊断单基因遗传病所进行的PGD 活检中，首选非接触性激光法打开透明带，避免化学方法对活检可能产生的影响［23］。取材之后需将其在室温下停留时间控制到最少，进行单胚胎培养。

活检一般选取第3天或6～8细胞期的卵裂球，此时细胞仍具有全能分化潜质，分析卵裂球DNA可以同时获取来自父母双方的遗传信息，现已成为大部分PGD 中心的主要取材途径。研究表明，活检1～2个卵裂球不会影响胚胎发育［24］。除此之外，囊胚及极体活检已成功应用于如囊性纤维化、地中海贫血等多种单基因病的PGD［25］。对于BRCA1／2基因的其他活检来源有待进一步的研究。

（三）诊断方法

1.巢氏PCR：PCR 是最早应用于分析单细胞DNA 以诊断胚胎单基因遗传性疾病的技术。巢氏PCR 具有内外两对引物，分两步进行反应，同时，外侧产物能够作为内侧引物PCR 所需模板，从而使内侧PCR 过程得以重复进行，目的基因产量进一步增加。Danuta 等［26］对 巢 氏PCR 及 全 基 因 组 扩 增（whole genome amplification，WGA）用于BRCA1基因突变的PGD 检测方法进行了比较，结果提示巢氏PCR 灵敏度、特异度更高，而WGA 相对可重复性较低。

2.多重PCR：是指针对基因组多位点采用相互之间无作用的多对引物进行混合，在同一PCR 反应中可以同时扩增。该方法同样适用于非整倍体的检测，已成为各PGD 中心主要采用的方法。通过同时分析多个短串联重复序列（short tandem repeat，STR）进行连锁分析，可以有效降低等位基因脱扣（allele dropout，ADO），提高PGD 准确率。

多态性连锁标记是指位于目的基因内部或外部与基因紧密连锁的短串联重复序列，标记的选择需要对夫妻双方以及其他家人（特别是患病家属）进行遗传性分析。Ramon等［27］的研究运用两个标记点对一个BRCA1 基因特异突变进行了PGD；Drüsedau等［28］分 别 设 计 了6 个（BRCA1）和8 个（BRCA2）微卫星标记对突变携带者进行检测分析，对30对夫妻进行了共47次PGD 周期，并有8人妊娠。研究表明，同时分析两个连锁基因位点可以把ADO 降 低 为 3.5%，同 时 分 析 三 个 可 降至1.5%［29］。

3.全基因组扩增（WGA）：PCR 技术以单细胞为模板，DNA 量少，扩增效率低。WGA 旨在非选择性的扩增单细胞全部基因组，为遗传检测提供足量的样本。在PGD 中最常用的是引物延伸预扩增（primer extension preamplification，PEP）。PEP采用随机组成的15 个碱基引物序列对基因组DNA进行扩增，为实现微量DNA 多基因位点分析和重复检测提供了可能。1998年Wells等［30］研究表明，PEP能扩增90%以上的基因组序列。目前，WGA技术已在假肥大性肌营养不良（DMD）、甲型血友病、囊性纤维化病等单基因遗传病中成功应用。

4.新 一 代 测 序 技 术（next-generation sequencing，NGS）：DNA 测序技术的高速发展使得测序广泛应用于生物信息等各个研究领域，NGS主要通过将基因组DNA 分切为小片段DNA，在这些小片段DNA 分子末端连接测序接头制备文库，随后通过对图像采集分析获得测序结果。单细胞全基因组测序正逐步应用于植入前胚胎单基因遗传病的筛查。

三、BRCA1／2的PGD 存在的问题及解决方案

1.扩增失败：PGD 过程中，扩增失败率高是最主要的缺陷之一。单细胞PCR 有限的遗传物质数量要求研究人员必须尽可能优化反应条件，以增加扩增准确性。

2.污染：污染是PCR 反应中的常见问题，PGD-PCR 中因模板量少需增加循环次数，这一过程使得污染问题更为显著。污染主要来自于活检材料本身以及PCR 过程中使用到的设备和试剂。为减少污染所带来的误诊风险，每一样本均需设立严格的阴性对照；卵裂球活检在移入PCR 管前建议反复洗脱；配备专用器材；所有操作限定在无菌层流条件下进行，尽可能地闭管操作以消除外源性污染。

3.等位基因脱扣（ADO）：活检胚胎中有一个等位基因未能完成扩增，即出现ADO 现象，尤其是对于BRCA1／2基因一类的常染色体显性遗传，ADO的发生使得异常突变不能被检出，将导致假阴性结果。多态性连锁标记是最常见规避ADO 的方法。除此之外，荧光PCR［31］、提高变性温度、同时检测两个卵裂球均有报道可以降低ADO 率［32］。只有扩增效率大于90%、ADO 率小于10%的PGD 技术才可以考虑应用于临床［28］。

4.针对BRCA1／2基因诊断的限制因素及个性化方案：BRCA1／2突变基因携带者虽然乳腺癌的终身发病率高，但关于携带者进行PGD 的争议仍然存在。因其迟发性及不完全显性等问题，携带者可以对后代进行定期检查、尽早治疗等措施干预，限制了PGD 这一过程的选择。另外，由于IVF存在妊娠率降低、卵巢刺激以及伴随产生的高额费用等问题，PGD 更加适用于并存不孕问题的携带者，以及在乳腺癌患者化疗前进行。有报道称，携带BRCA1 突变的女性在PGD 后诊断为乳腺癌，PGD 周期期间对母体使用激素后的安全性问题不容忽视，有待进一步完善［33］。

鉴于PGD 中单细胞遗传物质较少，单基因检测要求敏感度更高的实验标准。单细胞多重PCR 结合多态性连锁标记的方法能够最大程度地提高扩增效率，降低扩增失败、等位基因缺失等带来的阴性风险，是检测BRCA1／2基因的理想方法，已被广泛用于BRCA1／2基因PGD［27-29］。因PGD 技术的局限性以及无可避免存在一定比例的误诊，进行植入前诊断需保证患者知情同意，医患双方共同承担诊疗选择和决定的风险，从而使PGD 技术遵循伦理学基本原则［34］。

四、BRCA1／2的PGD 应用前景

近十几年来我国乳腺癌发病率逐年上升，尤其在京津沪等大中城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤的首位且发病年龄趋于年轻［35］。随着辅助生殖技术的逐渐推广，能够从植入前水平减少基因类疾病的遗传，实现优生优育，减轻家庭及社会负担。PGD对BRCA1／2基因突变遗传预防具有重要的临床意义。PGD 技术需要在不损害胚胎发育潜能的前提下，在有限的材料上进行遗传性分析，最终将检测后无基因突变的胚胎植入适合妊娠的子宫中。这一复杂过程需要医学遗传学家、分子生物学家以及生殖医学临床专家的共同协作。目前，国外已有BRCA1／2基因突变携带者通过PGD 诞生无突变基因的健康胎儿的报道［19］，而我国PGD 研究更是具有很大潜力。我们期待随着分子生物学、生殖遗传学、组织胚胎学等技术的不断发展，建立起成熟准确的BRCA1／2突变基因的PGD 技术。

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