赵春娟，高文惠（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄　050000）



饲料及畜产品中激素残留检测方法研究进展

赵春娟，高文惠*
（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄050000）

摘要：随着养殖业与畜牧业的快速发展，各种激素、饲料添加剂被广泛使用，而饲料及畜产品中激素残留会对环境和人体健康产生影响。因此，对饲料及畜产品中激素残留检测方法的研究尤为重要。文章综述了饲料及畜产品中激素残留检测技术。

关键词：饲料；畜产品；激素残留；检测方法

近几年，饲料及畜产品中激素残留污染问题引起世界上的广泛关注。在动物饲养及其饲料加工过程中滥用激素，最终导致畜产品被激素残留污染[1]。因此，必须要加强对饲料中违禁类激素的检测，从源头上控制激素残留。研究表明，在一定的饲养条件下，一些激素类药物在动物喂养期间可以引起蛋白质沉淀，提高饲料转化利用率，加快动物增重速度，取得更显著的经济效益。但残留于畜产品中的激素类药物通过食物链进入人体，导致人体激素中毒，甚至一些残留激素存在致癌的潜在危害，严重威胁消费者的身体健康[2-3]。我国农业部已于2002年发布176号公告，明确规定禁止在饲料中添加己烯雌酚、雌二醇等雌性激素，炔诺醇、左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，苯丙酸诺龙等雄性激素以及蛋白同化激素。但受经济利益的驱使，饲料中违规添加激素的事件仍时有出现，因此，检测饲料及畜产品中激素等添加剂具有重要意义。

常见的激素类物质主要包括甾体激素和非甾体类激素。饲料及畜产品中的激素主要包括β-兴奋剂、性激素、动物生长素等。目前，饲料及畜产品中激素残留检测方法主要包括高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、高效毛细管电泳法以及免疫分析法等[4-14]。其中免疫分析法根据其标记物的种类又可分为放射免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光酶免疫分析法。

1　高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）是分析检测中常用的方法，可以在常温条件下实现对高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质进行检测。鉴于其高效、高灵敏度的特点在激素残留检测领域得到了广泛的应用，同时为建立液相色谱-质谱联用法奠定了基础。刘红菊等采用固相萃取反相高效液相色谱法对饲料中10种性激素进行测定，样品经乙腈超声提取，并选用乙腈-水进行梯度洗脱，试验结果表明，10种性激素线性关系良好，相关系数均> 0.999 8，加标回收率为95.32%～102.5%，RSD< 1.8%[15]。该方法简单可靠，样品的杂质干扰较少，适用于饲料中违禁性激素的残留分析。李兰等采用DAD二极管陈列检测器同时检测饲料中的5种糖皮质激素，为保证各组分有良好的分离度和合理的分析时间，采用梯度淋洗，5种组分的分离度均>1.5，分峰型尖锐，分析时间28 min，在猪配合饲料中，3个浓度水平的5种糖皮质激素的回收率>66.5%，RSD≤10.6；在鸡配合饲料中，3个浓度水平的5种糖皮质激素的回收率>66.4%，RSD≤10.0[16]。卢艳芬等建立高效液相色谱法同时测定饲料中的克伦特罗和莱克多巴胺，建立了酸性甲醇-水混合溶液提取、混合有机溶剂萃取、固相萃取柱净化、反相色谱柱分离、双波长紫外检测器检测相结合的方法，样品加标回收率为62%～97%，RSD<10%，该方法与单独测定两种β-激动剂相比省时省力，降低检测成本，实现了两种物质的同时测定，能够满足饲料中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺监控检测的要求[17]。Fan等通过超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS/MS）测定了10类固醇激素，结果表明，应用此方法，分析物在MS/MS上的响应值和类固醇激素的浓度间有很好的线性关系，其检测限为0.01 μg·kg-1，鸡肉、猪肉、牛肉和香肠样品中加标回收率是76.8%～98.7%，RSD<10%[18]。该方法具有较高的灵敏度和重复性，并能在成分复杂的食物中迅速检测出类固醇激素的残留量。

2　液质联用法

液质联用法（LC-MS）是以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统的一种检测方法。样品在质谱中与流动相分离，样品被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质荷比（m/z）分离，经检测器得到质谱图。液质联用法体现了色谱和质谱的优势互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在食品分析、药物分析、环境分析等领域得到了广泛的应用。张毅等建立了谷物类饲料中10种雄性激素、11种孕激素、10种糖皮质激素、5种雌性激素以及5种二羟基苯甲酸内酯类药物的液相色谱-串联质谱（LC- MS/ MS）检测方法，均质样品经乙酸乙酯提取，以改良的QuEChERS吸附剂分散于提取液中实现快速净化，采用C18色谱柱分离，分别在正、负电喷雾串联质谱多反应监测模式下检测，试验优化了影响QuEChERS净化效果和LC-MS /MS分析性能的主要因素[19]。所建立方法的前处理过程简便、净化效率高，方法的灵敏度、回收率和精密度能较好地满足禁用激素测定的要求。该方法为谷物类饲料中禁用激素的监控和管理提供了良好的技术支持。张文刚等采用超高效液相色谱-串联质谱法检测饲料中6种玉米赤霉醇激素类药物，试验中对样品的前处理和仪器检测条件进行优化，在0.5～100 μg·kg-1线性良好，检出限为2 μg·kg-1，标准添加回收率为63.5%～117%，适用于饲料中玉米赤霉醇类药物的分析检测[20]。潘云山等用高效液相色谱串联三重四极杆质谱检测饲料中10种β-受体激动剂，样品经高氯酸提取、HLB柱净化，C18色谱柱分离，电喷雾（ESI）离子源电离，多反应监测（MRM）对10种受体激动剂进行定性、定量分析，试验结果显示，10种目标物质在0.5～40 μg·L-1线性良好，相关系数> 0.999，回收率为71.2%～103%，相对标准偏差3.7%～ 9.8%，方法定量限（S/N=10）为0.01 mg·kg-1[21]。该方法样品处理简单，灵敏度高，定性准确，可用于饲料中β-受体激动剂的定性、定量检测。Kaklama⁃nos等采用液相色谱-串联质谱法测定牛血清中12种合成代谢类固醇，蛋白沉淀后，血清样品经过HLB固相萃取小柱净化，在正、负两种大气压化学电离模式下，采用多重反应对其进行检测，试验结果显示，检测限为0.02～0.12 ng·mL-1，回收率为70.2%～118.2%，该方法灵敏、准确、选择性强，适用于类固醇激素的高通量定量分析[22]。Yang等建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测猪肝、牛奶、肌肉当中50种蛋白同化激素，目标物经过酶解后用甲醇提取，经石墨碳化氨基柱净化后上机测定，试验结果表明，定量限为0.04～2.0 μg·kg-1，平均回收率为76.9%～121.3%，RSD为2.4%～21.2%[23]。

3　气质联用法

气质联用法（GC-MS）是将气相色谱仪与质谱仪通过适当接口相结合，借助计算机技术，进行联用分析的技术。将气相色谱法的高分离优势与质谱法的高鉴别能力相结合。气质联用法具有灵敏度更高，定性、定量准确等优点，可以在多种残留物同时存在的情况下对其中的某种特定物质进行定量、定性检测。但气质联用法要求目标物质沸点较低、热稳定好。李胜等采用气相色谱-质谱法测定饲料中莱克多巴胺，样品经N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺衍生，选用选择监测离子模式进行检测，试验结果表明，莱克多巴胺衍生物的峰面积与其浓度为20.0～1 000 μg·L-1范围内呈良好的线性关系，相关系数>0.997，样品加标回收率为67.5%～92.3%，变异系数为3.0%～12%，方法检出限达5 μg·kg-1[24]。杨柳等建立了气质联用法对乳牛饲料中领苯二甲酸酯类环境激素进行测定，样品经乙腈超声提取30 min，结果显示，回收率为85.42%～104.92%，标准偏差为1.12%～4.97%，方法准确可靠；对乳牛饲料样品中6种邻苯二甲酸酯类环境激素进行了检测，其中邻苯二甲酸正二丁酯（DnBP）和邻苯二甲酸二（2-乙基）乙酯（DEHP）含量相对较高，青贮饲料中单项和总邻苯二甲酸酯类环境激素（PAEs）含量高于精饲料[25]。林维宣等建立了动物组织10种β-兴奋剂类兽药残留量的气相色谱-质谱法检测方法，样品经pH 5.2乙酸钠溶液提取，提取液依次经乙酸乙酯-异丙醇（60ϑ40）混合溶剂和叔丁基甲醚-异丙醇（5ϑ1）萃取净化，再经Strata-X-C阳离子交换柱（500 mg, 3 mL）净化后，用BSTFAϑTMCS（99ϑ1）衍生剂衍生，采用HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱进行气相色谱-质谱法分析，通过对质谱条件的一系列优化，兼顾各成分的灵敏度，建立了最佳质谱分析条件，10种β-兴奋剂类兽药检出限1～5 μg·kg-1。室内平均回收率为59.1%～77.4%，变异系数（CV%）为0.87～7.04[26]。该方法的检测限、回收率和精密度等技术指标满足对β-兴奋剂残留量检测的有关要求。Zeng等建立了猪肉组织中8种合成代谢类固醇激素的GC-MS多残留检测方法，样品经液液萃取、净化后，在最佳试验条件下，8种目标物质在2.5～50 μg·kg-1线性关系良好，回收率为67.7%～ 120%，方法可靠、适用[27]。

4　毛细管电泳技术

毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。该技术具有分离效率高、分析速度快、样品前处理简单等优点。张敬敬等建立了一种应用毛细管电泳法快速、高效分离畜产品中β-受体激动剂的方法，在最佳试验条件下，4 min内实现了克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇3种β-受体激动剂的基线分离。在8～100 μg·mL-1线性关系良好，相关系数>0.997 1，平均回收率为89.20%～95.34%，RSD≤3.33%（n=5），伦特罗和莱克多巴胺的检测限均为4.5 μg·mL-1，沙丁胺醇的检测限为5.5 μg·mL-1[28]。段建平等建立了同时测定饲料中西马特罗、盐酸克伦特罗与沙丁胺醇的毛细管区带电泳-紫外检测方法，考查试验参数对分离和检测结果的影响，最佳试验条件下，在60 mmol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠运行缓冲液（pH=6）中，上述3种物质在8 min内完全分离，西马特罗、盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的线性响应范围为0.1～1.0 mg·L-1，最低检测限（以信噪比为3计）分别为0.02，0.03和0.02 mg·L-1[29]。

5　免疫分析法

5.1放射免疫分析法

放射免疫标记技术（RIA）是采用放射性同位素的抗原或抗体来检查相应抗体或抗原的高灵敏度免疫分析方法，此法具有高灵敏度（10-9或10-12），可进行超微量分析。本法常用同位素有3H、14C、125I和131I等。放射免疫分析法应用范围广泛，在食品安全检测中可用来检测肉类药物残留，黄曲霉毒素等。林杰等应用CharmⅡ放射免疫分析方法测定饲料样品的磺胺类残留，该检测方法可靠，灵敏度高，特异性强，且快速简便，在60 min内可出初筛结果，假阴性率为0，特别有助于大批量样品的初筛检测[30]。但是，由于该检测方法是基于微生物受体反应，检测结果有假阳性的可能，因此，初筛阳性的样品必须用其他方法进行确证。CharmⅡ放射免疫分析方法作为目前一种快捷可靠的检测手段，值得推广应用。周浩等应用放射免疫法检测饲料中四环素类抗生素残留，建立快速筛选方法，确定了样品处理及控制点设定的方法，用液相色谱质谱（LC-MS）法验证了放射免疫分析法筛选的样品，符合率达100%，且该方法特异性强，与氯霉素、红霉素、链霉素、青霉素G、磺胺嘧啶等其他抗生素无交叉反应。饲料样品前处理简单、干扰因素小，只需简单处理便可检测，从接收样品到出结果，整个过程约20 min，阴性结果不仅表明该样品中含四环素族单种抗生素浓度分别<50 μg·kg-1，同时也可表明，四环素族浓度总和≤50 μg·kg-1[31]。所以，CharmⅡ放射免疫法提供了一种快速、有效的筛选检测饲料中多种四环素类药物的方法。

5.2酶联免疫吸附法

酶联免疫分析法（ELISA）是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶联免疫技术，根据抗原-抗体反应动力学可分为竞争性和非竞争性两种。根据反应体系与检测体系之间的关系分为直接法、间接法。其中间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体。李瑞园等建立了饲料中己烯雌酚定量的酶联免疫吸附测定法，试验结果显示，己烯雌酚在0～4.5μg·kg-1呈现良好的线性关系，相关系数为0.9997，样品加标平均回收率为76%～94.2%，该方法灵敏度高，适合饲料中己烯雌酚检测，且适用于大批量样品的筛选[32]。徐新慧等用竞争性酶免疫分析法快速定量测定43个小麦样品中玉米赤霉烯酮毒素的含量，分析结果表明，玉米赤霉烯酮在0.5～450 μg·kg-1线性关系良好，相关系数为0.997 36[36]。贾涛等采用酶联免疫法测定饲料中的莱克多巴胺，试验研究表明，该方法的回收率>95%，相关系数>0.99，最低检测限可达到0.5 ng·mL-1[34]。本方法适用于饲料及饲料添加剂中莱克多巴胺的快速测定。但由于该方法检测结果可能出现假阳性结果，因此初筛阳性结果必须采用其他方法确认。

5.3时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是一种新型的体外超微量分析技术。TRFIA利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。何明祥采用包被二抗间接竞争法，以抗SAL二抗体包被96微孔板作为固相二抗，与游离SAL间接竞争限量的以Eu3+标记的SAL-OVA抗原，建立解离增强模式的荧光免疫分析体系检测沙丁胺醇（SAL），以利用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术建立快速、高灵敏度的沙丁胺醇（SAL）全自动检测方法，结果表明该法的灵敏度为0.04 ng·mL-1，批内和批间变异系数分别为2.2%和8.7%，平均回收率为106.5%，与盐酸克伦、莱克多巴胺的交叉反应率分别为0.93%和0.73%[35]。由此可见，用TRFIA法检测SAL，灵敏度高、特异性强、稳定性好，具有良好的应用前景。王超等采用时间分辨荧光技术建立高灵敏的玉米赤霉烯酮（ZEN）间接竞争免疫分析法（ZEN-TRFIA），以玉米赤霉烯酮人工抗原（ZENBSA）包被96孔板为固相抗原，与ZEN标准或样品中的ZEN共同竞争有限的抗ZEN的单抗，用稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪，该方法的灵敏度为0.01 μg·L-1，测量范围为0.01～20.00 μg·L-1，批内和批间变异分别为7.2%和14.6%，平均回收率为94.4%，与玉米赤霉醇（ZER）的交叉反应率为15.16%，7条不同时间进行的ZEN-TRFIA的效应点值（ED）ED20、ED50和ED80分别为0.156±0.024、0.634±0.049和2.595±0.225 μg·L-1，试剂盒4℃保质期超过6个月，研究表明，ZEN-TRFIA是目前报道的ZEN检测中较灵敏的方法，该分析方法稳定性好，货架期符合要求，可测范围宽，具有很好的应用前景[36]。Shen等通过时间分辨荧光技术（TR-FLA）从猪组织中筛查莱克多巴胺，该方法是基于直接竞争免疫法，莱克多巴胺-卵清蛋白作为固相抗原，用铕标记单克隆抗体进行示踪，当猪肝脏和肌肉中莱克多巴胺的含量达到1～10 μg·kg-1时，回收率可达88.2%～118.5%，且其变异系数为7.1%～20.5%，检出限为0.1 μg·kg-1。通过液质联用法验证，时间分辨荧光技术对检出猪组织中的莱克多巴胺具有很好的效果[37]。

5.4化学发光酶免疫分析法

化学发光免疫分析（CLIA）方法是基于放射免疫分析的基本原理，将酶的化学发光与免疫反应结合起来，进而发展来的一种分析方法。CLIA是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，通过测量发光强度，根据标准曲线测定待测物的浓度。其主要优点是灵敏度高、线性范围宽、标记物的有效期长、无放射性危害、可实现全自动化等。李细芬研究了小分子半抗原与载体蛋白结合的方法，最终采用重氮盐法制备出盐酸克伦特罗的人工免疫原、包被原和酶标抗原，用人工免疫原免疫新西兰大白兔，制备出高效价和高特异性的盐酸克伦特罗抗体。通过优化各项实验条件，建立了简便、快捷、实用的盐酸克伦特罗直接竞争化学发光酶免疫分析方法。对所建立方法的性能指标进行系统评价，考查了方法的检测限、定量限、精密度、准确度。该方法检测灵敏度较高，灵敏度为0.25 μg·kg-1，检测限为0.02 μg·kg-1，批间和批内变异系数均<20%[38]。卢江等应用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，建立了一种简便、快速、高特异性的间接竞争化学发光酶免疫法用于检测玉米中的玉米赤霉烯酮。所建立的方法分析灵敏度为0.09 ng·mL-1，批内变异系数<9.1%，批间变异系数< 14.7%，样品的加标回收率为79.6%～97.6%，所建立的标准曲线相关系数为0.988 4，检测线性范围为0.104～1.69 ng·mL-1，检测时间为60 min[39]。

6　小结

随着人们对动物性食品需求量的增加，动物性食品中的激素残留也越来越成为全社会共同关注的公共卫生问题。采用选择性好、快捷的检测手段是今后发展方向。应从源头控制激素类物质添加，指导和帮助养殖业科学养殖，严格控制滥用动物抗生素和激素，在畜牧生产实践中规范用药，同时建立起一套药物残留监控体系，制定违规的相应处罚手段，有效地控制药物残留的发生，并发展选择性好、快捷的检测手段，确保动物性食品的食用安全和人类健康。

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前沿科技摘编

Determination Methods of Hormone Residues in Feeds and Animal Products

ZHAO Chunjuan, GAO Wenhui*
（College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, China）

Abstract:With the fast development of livestock and animal husbandry, a variety of hormones and feed addi⁃tives were widely used, and harmful to public health and environment. Therefore，it was particularly important that the detection methods of hormone residues were established in feeds and animal products. This paper reviewed the detection methods of hormone in feeds and animal products.

Key words:feed; animal product; hormone residue; detection method

*通信作者：博士，教授，E-mail：wenhuigao@126.com。

作者简介：赵春娟（1988-），女，河北张家口人，硕士研究生，研究方向为食品安全与检测。

基金项目：河北省科技支撑计划项目（14227504D，14236602D-13）

收稿日期：2014-08-29

中图分类号：S816；S872

文献标志码：A

文章编号：1001-0084（2015）01-0009-06