王宁



喹诺酮类抗菌药物耐药机制

王宁

（山东省泰安市岱岳区畜牧兽医局 271000）

喹诺酮类抗菌药物属化学合成药物，主要通过抑制菌体内DNA旋转酶及拓扑异构酶IV活性，最终抑制DNA合成而发挥抗菌作用。依据药物的化学结构、抗菌作用以及体内过程可将此类药物分为一、二、三及四代。第一代为萘啶酸，第二代代表药物为吡哌酸，氟奎诺酮类药物为第三代，第四代又称为新奎诺酮类。依据嗜水性又可分为亲水性和疏水性两类。各代之间抗菌谱、抗菌强度以及作用对象存在不同[1]。整体上看，奎诺酮类药物抗菌谱广、对革兰阴性菌抗菌活性强、体内部分广且剂型多样化，在临床抗感染过程中、尤其是多重耐药菌治疗中得到广泛应用。但近年来，临床分离菌株，尤其是大肠埃希菌对其耐药率显著提高。从分子水平上看，靶基因及非靶基因的多点突变，是大肠埃希菌针对奎诺酮类药物耐药的主要分子事件。从生化机理上看，细菌体内药物累积浓度降低、药物作用的靶酶或靶位点改变以及质粒介导耐药，是耐药的主要机制[2]。

1 细菌体内药物累积浓度降低

Nikaido等人于1994年研究报道，大肠埃希菌针对奎诺酮类药物耐药，与菌体内药物累积浓度减少有关[9]。国内方治平等人于2005年采用葡萄糖与能量抑制剂氰氯苯踪分别作用于敏感及耐药菌株后，通过荧光测定法检测菌体内奎诺酮类药物浓度，亦发现敏感菌株体内药物浓度显著高于耐药菌株，且MIC差异为160-1280倍，亦证明累积浓度下降，是大肠埃希菌耐药的关键环节之一。此种机制主要涉及细菌胞膜结构的改变以及外排系统的存在。

1.1 大肠埃希菌外膜通透性改变 膜孔蛋白为大肠埃希菌菌体外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)的一种，以三聚体镶嵌在细胞外膜的脂质层中并和胞外相通，形成胞内胞外物质交换的通道。大肠埃希菌存在5种不同的膜孔蛋白，即ompC、ompF、PhoE、lamB及蛋白K，前三者孔径大小分别为1.3nrn、2.4nm和1.2nm，其氨基酰序列及核苷酸序列非常相似，氨基酰序列中没有连续10个以上的亲水性氨基酰出现。耐药性大肠埃希菌中常出现ompF减少或缺失现象[3]。膜孔蛋白组成的通道为是奎诺酮类药物进入菌体内的主要途径，其表达量减少或缺失引起菌体内药物浓度降低，从而导致耐药的发生。资料显示，此种机制不能引起细菌高度耐药，但有其他耐药机制共存时，能明显提高细菌耐药程度。

1.2 存在主动外排系统 主动外排系统的存在，是大肠埃希菌多重耐药的主要机制之一。Van等人于2000年发现，大肠埃希菌菌株存在多种外排泵，最为重要的是质子依赖型AcrAB-TolC系统，该系统可使菌株对有机溶剂、染料、去污剂以及多种抗菌药物高度耐药。Touze于2004年采用基因敲除法证实菌株缺失acrAB及tolC基因时，抗菌药物敏感性大为提高，印证了Van等人的研究结果[14]。为探究AcrAB-Tolc系统的结构，Sennhauser、Fujihira等人采用定点突变的方法，对特殊位点氨基酰残基进行替换研究。结果显示该系统主要由三个部分组成，即膜融合蛋白(AcrA)、外排转运蛋白(AerB)和外膜通道蛋白(TolC)。AcrA、AerB和TolC以三聚体形式存在于大肠埃希菌的细胞膜上，其中AcrA位于周浆间隙中，两端连接着AerB和TolC；AerB和TolC分别位于细胞内膜和外膜上。在无底物结合时，AcrAB-TolC三聚体结构比较稳定。其通道开放或闭合取决与三聚体构象变化[17]。当胞内或周浆间隙内药物分子与AerB结合时，其构像发生改变，随之通过级联放大效应，引起AerA和TolC构像改变，AcrB和Tolc相互接触，外排通道开放。研究发现，药物分子外排主要和H十相关联，它们构成一个反向转运蛋白。通道开放后，H十发生内流，药物分子外排，最终降低菌体内药物有效浓度，引起菌株耐药。

2 药物作用靶位的突变

奎诺酮类抗菌药物主要作用靶位为DNA旋转酶及拓扑异构酶IV。药物间作用靶位存在差异。Hooper等人研究发现，环丙沙星等传统奎诺酮药物主要作用于DNA旋转酶，环丙沙星、加替沙星等新型药物可均衡作用于DNA旋转酶及拓扑异构酶IV。DNA旋转酶是由两个A亚基(GyrA)和两个B亚基(GyrB)组成四聚体，催化依赖于ATP的DNA负超螺旋，在DNA复制和转录的起始阶段起重要作用。奎诺酮类药物通过与旋转酶-DNA复合物结合而抑制DNA的断裂-重接循环[4-5]。拓扑异构酶IV是由两个C亚基(PartC)和两个E亚基组成的四聚体，在DNA复制后期起重要作用。奎诺酮类抗菌药物通过作用异构酶，从而干扰细菌的DNA复制、修复及转录等来杀菌。早年研究表明，大肠埃希菌基因组中存在奎诺酮类药物耐药决定区(QRDR)。该区定位于gyrA的5’末端67-106密码子区域。该区域的单位点突变引起MIC水平升高，但不显现耐药表型。同时两点以上突变，或者伴发有次要靶位突变时，可引起菌株针对奎诺酮类药物显著耐药[6]。菌株来源不同，QRDR突变位点存在差异。总的来看，大肠埃希菌QRDR主要位点为gyrA内83位丝氨酸和87位天冬氨酸，以及parc内79位丝氨酸和53位天冬氨酸。瑞士的Casson等于2006年研究后发现GyrA中val7o突变为Ser、PartC中Ala81突变为Thr以及Glu84突变为Pro均可引起大肠埃希菌对奎诺酮类耐药。07年采用PCR-SSCP技术，对40株耐奎诺酮类大肠埃希菌进行研究。发现除常见氨基酰突变外，37株菌株尚存在Asp87突变为Asn、Ala84突变为Pro[7-9]。日本的Niwa发现，突变氨基酰种类，对于耐药水平有一定的关系。其研究中揭示GyrA中QRDR中Asp突变为Gly，可显著增加耐药水平。

3 质粒介导耐药

大肠埃希菌针对奎诺酮类药物耐药机制，多归于染色体靶位突变或多重药物外排泵过度表达。近来研究表明，质粒介导的耐药(PMQR)亦发挥着重要作用。（1）1998年Mart等人将来源于肺炎克雷伯菌UABI的pMG252转化至其他菌株时，发现该质粒可显著提高宿主菌对环丙沙星的耐药水平，从而揭示了质粒介导菌株针对奎诺酮类药物耐药的机制[10]。后续研究探明，该机制涉及qnrA、aac(6’)-Ib-cr及qepA等基因参与，且不同基因在菌株中分布有所差异。qnrA为一段由657个核苷酸组成的开放读码框架，编码218个氨基酸序列。该基因呈全球性流行，常定位于I类整合子In4家族上，其亚型也不断发现。Tran等人2005年研究明确了Qnr的耐药机制。该蛋白可先于奎诺酮类药物特异性地与DNA旋转酶或IV型拓扑异构酶结合，通过减少酶与药物结合位点及改变酶蛋白构象，最终引起菌株耐药[15]。（2）氨基糖苷转移酶基因(aac(6’)-Ib)最早报道于1986年，现己有30多种相似基因型，主要介导菌株对氨基糖苷类药物耐药[11-13]。部分庆大霉素耐药大肠埃希菌中可发现aae(6’)-Ib-cr存在。与aae(6’)-Ib相比，其5’端多了12个独特的碱基对，同时存在多处点突变。Robiesek等人发现，当发生突变时，尤其是氨基酰序列中102位Trp突变为Arg，同时179位AsP突变为Tyr后，可引起宿主菌对部分奎诺酮类药物耐药。进一步研究表明，aac(6’)Ib-cr介导奎诺酮类耐药，主要通过对奎诺酮类药物哌嗪环上氨基氮原子进行乙酰化作用实现的[16]。（3）qepA是法国学者2007年发现的质粒基因，可介导宿主菌对亲水性奎诺酮类药物低水平耐药。同年，Yamane进一步明确了该基因的结构与功能。qepA由1536个核昔酰构成，编码蛋白包括511个氨基酸，为质子依赖型外排蛋白。该基因介导奎诺酮类耐药，主要通过QePA对亲水性奎诺酮类药物外排实现的[17]。（4）qnr、aac(6’)-Ib-cr及qepA均能够介导低水平奎诺酮类药物耐药，三者作用机制、作用位点存在差异。aac(6’)-Ib-cr及qepA在大肠埃希菌中更为多见。基于三者可共存于同一质粒上，三者可共同参与大肠埃希菌针对奎诺酮类药物的耐药性。

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（2015–06–05）

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