李雪娟 于 峰 综述 丁 洁 审校



·肾脏病基础·

局部补体产生在肾脏损伤中的意义

李雪娟1于 峰2综述 丁 洁1审校

补体是一组具有酶促反应活性的血清糖蛋白。补体系统参与了多种肾脏损伤的发生与发展，以往认为导致肾脏损伤的补体成分由“肾外”细胞产生(如肝细胞等)，通过循环到达肾脏而引起一系列补体介导的免疫反应及免疫损伤。近年国内外研究报道均显示，肝外组织如肾、脑、血管、肺等均能合成补体。肾脏是肝外补体合成的重要场所之一，并且肾脏局部产生的补体可能参与肾脏损伤的发生与发展。本文重点阐述肾脏局部固有细胞产生的补体成分在肾脏损伤中的意义。

补体蛋白 肾脏疾病 肾脏固有细胞

补体系统参与了多种肾脏损伤的发生与发展，以往认为导致肾脏损伤的补体成分是由“肾外”细胞产生，如肝细胞、脾细胞、红细胞和血小板等，通过循环到达肾脏而引起一系列补体介导的免疫反应及免疫损伤。而近年研究显示，肾脏是肝外补体合成的重要场所之一[1]，且肾脏局部产生的补体可能参与了肾脏损伤的发生与发展。

补体是一组具有酶促反应活性的血清糖蛋白。1896年，Bordet发现绵羊抗霍乱弧菌血清能够溶解霍乱弧菌，而加热至56℃，30 min后可阻止其活性,首次发现了补体[2]。补体系统包括30多种可溶性及膜结合性蛋白，是抵抗微生物感染的天然免疫系统的重要组分，同时在维持自身细胞完整性、组织稳态及适应性免疫反应中发挥非常重要的作用[3]。补体系统有经典途径、替代途径、甘露糖结合凝集素(MBL)三条活化途径。C3是三条活化途径的交汇点，由此继续活化补体的级联反应，产生一系列具有重要生物学效应的活性片段及终末产物——膜攻击复合物(MAC)。有意义的是，机体内还存在对抗补体过度活化的自我调节机制，主要由多种补体抑制因子完成，旨在维持自身系统的稳态，保护机体免受“异己”的损伤，在病理状态下，这种平衡被打破，补体系统则会参与多种炎症反应及自身免疫性疾病的发生。

近年来多项研究均显示，肝外组织如肾脏、脑、肺、关节、皮肤和血管等也能合成少量具有重要生物学意义的补体成分。1999年，Tang等[4]首次对肾脏分泌的补体C3在人类补体循环池中所占的比例进行了研究，提示肾脏是肝外组织合成补体的重要场所,且肾脏局部合成的补体成分还可进一步影响并参与肾脏损伤的发生。既往研究证实肾脏固有细胞可在局部合成几乎所有的补体成分[4-5]。本文重点阐述肾脏局部固有细胞产生的补体成分在肾脏损伤中的意义。

肾小球上皮细胞

肾小球上皮细胞分为脏层上皮细胞和壁层上皮细胞，其中脏层上皮细胞既是肾小球滤过屏障的重要组成部分，又是补体介导的免疫复合物性肾小球肾炎损伤的靶细胞之一[6]。体外实验或动物实验均证实，肾小球脏层上皮细胞可产生多种补体成分，如C3、C4、CR1、Crry等[5,7]。研究显示，免疫损伤时，补体C3b会与肾小球上皮细胞表面的受体相结合而参与免疫复合物的清除。那么肾小球上皮细胞局部合成的补体成分与免疫炎症的关系如何呢？

1993年，Zhou等[7]经过一系列的实验研究，体外分离培养人肾小球上皮细胞，利用代谢标记及免疫共沉淀等实验方法，报道了人肾小球上皮细胞能够分泌补体C3、C4，并且在γ干扰素(IFN-γ)的作用下，C4基因水平表达增加。其后，Laufer等[8]也发现，人肾小球上皮细胞能够合成C1r、C1s、C1抑制物、C3、C2和B因子等补体成分。2005年，Bao等[9]发现了狼疮性肾炎小鼠模型中肾小球脏层和壁层上皮细胞均能合成C3a受体(C3aR)，随着疾病的进展，其表达量增加。由于C3是补体三条活化通路的核心，其在补体相关疾病的发生中具有重要的地位。近年来，C3基因敲除的动物模型及分子生物学实验技术的发展使得有关C3的研究有了长足的进展。2008年，Sheerin等[10]将C3基因敲除小鼠的肾脏移植到正常小鼠，再用阿霉素处理后则不能诱导其产生蛋白尿、肾小管损伤及进行性肾衰竭,这一研究结果提示肾脏局部合成的补体成分是蛋白尿相关的肾组织损伤的关键环节，同时也为局部组织产生的补体蛋白可能参与其他位点的组织炎症损伤提供了可能。但也有研究不支持这一观点，其实验结果显示循环中通过肾小球滤过的C3加重了蛋白尿的肾小管损伤，而肾小管上皮细胞局部合成的C3与肾小管间质损伤的严重程度及蛋白尿的发生无关[11]。北京大学第一医院丁洁课题组的前期工作建立了经典的嘌呤霉素大鼠肾病模型，进一步应用基因芯片生物信息学的方法分析发现，蛋白尿发生发展及足突动态变化中肾组织局部显示多个补体成分高表达[12]。而早期动物模型的研究发现补体的作用可能并非都有害[13]，补体可能会通过抑制局部免疫复合物的沉积而保护肾脏免受损伤。故肾小球上皮细胞局部合成补体的机制和目的尚有待进一步研究。

近年的研究还发现，肾小球上皮细胞能够表达多种补体调节蛋白，如可溶性的补体调节蛋白H因子，膜结合型的补体调节蛋白，Ⅰ型补体受体(CR1/CD35)、衰变加速因子(DAF/CD55)、膜辅助蛋白(MCP/CD46)及补体调节蛋白CD59等[14]。

H因子作为一类重要的可溶性的补体调节蛋白，不论是在血管内还是在细胞表面均参与控制C3转化酶的生成及稳定性。2003年，Ren 等[15]利用补体活化的大鼠肾小球上皮细胞及Heymann肾炎膜性肾病的大鼠模型，通过实时定量PCR(RT-PCR)检测肾脏局部H因子mRNA的表达，结果显示，无论是体内还是体外实验，H因子表达均上调，这很可能是肾小球上皮细胞对膜性肾病的直接反应，从而发挥调节作用。2007年Alexander等[16]研究发现，小鼠肾小球上皮细胞局部产生的补体H因子对慢性血清病所致的弥漫增生性肾小球肾炎肾组织上皮下沉积的免疫复合物的清除具有非常重要的作用。而循环中H因子的缺乏或功能缺陷也已证明与许多疾病的发生(如不典型溶血尿毒综合征、C3肾小球肾炎等)相关。

CR1是C3b的受体，可介导吞噬作用，并作为Ⅰ因子的辅助因子促进C3b和C4b的降解。Quigg等[17]证明了大鼠的肾小球上皮细胞能够表达CR1-mRNA。在急进性肾小球肾炎、膜性肾病、狼疮性肾炎及糖尿病性肾小球硬化症的患者肾活检时，肾小球上皮细胞的CR1表达消失，推测可能是由于肾小球上皮细胞数目减少或代谢异常所致。

DAF通过抑制C3、C5转化酶的形成而发挥作用。2002年，Bao等[18]利用免疫荧光及电镜等方法研究了大鼠体内DAF的分布及功能，证实了DAF可在其肾小球脏层上皮细胞表达。在嘌呤霉素(PAN)诱导的大量蛋白尿肾病模型中，DAF表达的上调可能会发挥其保护肾脏的功能。

肾小球系膜细胞

既往文献报道，肾小球系膜细胞能够产生C2、C3、C4、C3aR、B因子及 H因子等补体成分[19-20]。

1993年 Sacks等[19]利用体外原代培养的人肾小球系膜细胞，使用35S代谢标记及免疫共沉淀的方法发现，肾小球系膜细胞能够表达补体C3及C4；经过IFN-γ的刺激后，C3mRNA的表达无变化，但C4mRNA的表达增加，说明IFN-γ能够调节肾小球系膜细胞补体C4基因的表达。

由于补体参与了多种原发性及继发性肾小球肾炎的发病[21]，如狼疮性肾炎及IgA肾病的肾脏病理上均有系膜细胞增生及系膜区免疫复合物的沉积。那么，系膜细胞局部合成的补体成分意义何在呢？Wan等[20]利用siRNA敲低人肾小球系膜细胞内源性C3的表达后，观察其对肾小球系膜细胞的表型及增殖状态的影响，结果发现重型钙调蛋白结合蛋白(h-caldesmon)(收缩表型的标记)的mRNA表达增加，而骨桥蛋白、基质Gla蛋白(MGP)和Ⅳ型胶原 mRNA(合成表型的标记)的表达减少，从而降低了人系膜细胞的增殖，这些结果均提示肾小球系膜细胞局部产生的补体C3可能影响肾小球系膜细胞的表型及增殖状态，进一步提示C3可能在肾脏疾病中肾小球系膜细胞表型的调控方面发挥重要作用。

肾小球内皮细胞

1997年，Sheerin 等[22]的研究发现肾小球内皮细胞能够合成补体C3，在肿瘤坏死因子α(TNF-α)的刺激下，其表达增加。另有研究显示，肾小球内皮细胞能够表达补体调节蛋白CD59[23]。2007年，有学者发现狼疮性肾炎患者中肾小球内皮细胞C3aR的表达增加，研究采用Western Blot和免疫荧光染色的方法,免疫荧光染色结果是两位病理专家在双盲情况下进行评分,发现C3aR染色强度与狼疮性肾炎的整体组织活动的评分呈明显正相关，而作为对照的其他肾脏疾病并未出现[24]。而进一步在动物体内利用特异性C3aR拮抗剂阻断C3a/C3aR通路后，则延长了狼疮肾炎小鼠的生存时间[25]。

肾小管上皮细胞

近年来国内外的研究均表明，肾小管上皮细胞是肾脏中多种补体固有成分(如C3、C4、C2、C1q、D因子、H因子)mRNA表达和相应蛋白合成的重要场所[26]。Ichida等[27]认为，由于补体调节蛋白(如CD46、CD55等)在肾小管上皮细胞表达相对较少，故肾小管上皮细胞可能是补体局部沉积和MAC作用的主要靶点。体外培养的近端肾小管上皮细胞未经任何刺激即可表达补体C3，在TNF-β的刺激下，其表达量增加，且呈剂量和时间依赖性。Castellano等[28]也证实白细胞介素β(IL-1β)及IFN-能使近端小管上皮细胞分泌C3增高。

近年来，有关肾小管上皮细胞局部分泌补体的研究多集中于肾脏移植免疫的领域。相关研究结果发现，移植肾“失功”和排异反应的发生与供肾局部，尤其是肾小管上皮细胞C3的过度活化密切相关[29]。急性排斥反应是早期器官移植失败的重要原因，同时也会进一步影响到移植器官的存活时间。研究显示，补体的替代途径活化参与肾脏移植后的缺血再灌注损伤。由于肾小管上皮细胞代谢旺盛，易受到缺血再灌注损伤的影响，而肾小管上皮细胞几乎可以产生替代途径中所有的补体成分。有文献报道，发生肾脏移植排斥反应时，近端肾小管上皮细胞表达的C3会上调，而在小鼠移植肾模型的研究中，来自C3阴性(非特异性敲除)的小鼠肾脏移植后的存活时间远远大于C3阳性的小鼠[30]。Sacks 等[31]在一项前瞻性、随机对照研究中发现，肾活检病理中肾小管C3基因的表达强度不但与肾小管间质损伤程度有关，更与肾小球的滤过功能呈负相关。因此，肾小管上皮细胞在致病因素诱导下过度生成并活化补体，在移植肾相关肾损伤发病中的作用已引起广泛重视。

肾小管上皮细胞不仅能够直接合成补体，还可合成部分补体的受体成分，如C3a及C5a的受体[32-33]。 2004年，Braun等[32]利用流式细胞分选(FACS)、Western Blot和RT-PCR技术发现，人近端肾小管上皮细胞可表达C3aR，利用基因芯片技术检测在近端肾小管C3aR活化后引发的基因转录调节，提示补体的活化可直接调节肾脏免疫炎症反应。随后Tang等[34]利用C3a刺激肾小管上皮细胞后发现，上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)表达减低，α平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原的mRNA表达上调，加入C3aR拮抗剂后，则抑制了上皮细胞向间充质细胞的转化；在阿霉素诱导的肾蛋白尿肾脏小鼠模型中，C3aR(-/-)组比野生组损伤轻，间质的α平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原的含量也明显降低，提示敲除C3aR对肾功能的保护作用。2003年，de Vries 等[33]发现C5aR在健康小鼠的肾小管上皮细胞有表达，在此基础之上建立了缺血再灌注模型后发现，其C5aR表达上调，CXC 趋化因子和TNF-的mRNA的表达也明显上调，并伴有大量中性粒细胞浸润；而C5aR通路被阻断后，则只有CXC趋化因子的表达上调。这一研究提示C5a及其受体在肾脏缺血再灌注发病中的重要性。2011年国内也有学者报道[35]，体外培养的人近端肾小管上皮细胞在C3a及C5a的诱导下，其相应的受体mRNA表达均增强，并激活了转化生长因子β1(TGF-β1)/结缔组织生长因子(CTGF)的信号通路，最终导致肾小管上皮细胞转分化。以上研究表明，肾小管上皮细胞合成的补体及相关受体在介导炎症及促纤维化的相关通路中可能具有重要作用

综上所述，肾脏固有细胞可合成多种补体及相关成分，并可能参与多种肾脏疾病的发生和发展。但是肾脏固有细胞到底能合成哪些补体分子？这些原位合成的补体成分的表达变化特点？自身合成的补体成分如何发挥生物学功能？原位合成补体成分的数量与在肾外合成的补体成分数量及功能上有无差异？诸多问题均需要进一步的实验研究，为未来防治免疫相关肾脏疾病进展的研究提供理论依据。

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(本文编辑 律 舟 加 则)

The renal locally produced complement and kidney injury

LIXuejuan1,YUFeng2,DINGJie1

1DepartmentofPediatrics,PekingUniversityFirstHospital,No.1XiAnMenDaJie,Beijing,100034,PR.China2RenalDivision,DepartmentofMedicine,PekingUniversityFirstHospital;InstituteofNephrology,PekingUniversityKeylaboratoryofRenalDisease,MinistryofHealthofChina;KeylaboratoryofCKDPreventionandTreatment,MinistryofEducationofChina;Beijing100034,China

Complement comprises approximately 40 serum proteins, glycoproteins that exhibit enzymatic activity. Evidence increasingly indicates that the complement system plays a pivotal role in mediating renal diseases. Although complement components are produced in the liver, in recent years, many studies have shown that extrahepatic tissues, including the kidney, brain, blood vessels, lungs, can synthesize small amounts of complement components. Among extrahepatic tissues, the kidney is one of the main sites of complement synthesis. However, recent evidence also suggested that locally expressed complement proteins are involved in renal injury. This review is mainly focus on the significance of renal locally produced complement in renal diseases.

complement renal cells renal diseases

国家自然科学基金面上项目(81170657)；国家自然科学基金重点项目(30830105)；国家重点基础研究发展计划(973，2012CB517700)；北京市自然科学基金(7072080)

1北京大学第一医院儿科(北京，100034)，2肾内科

2015-06-01