胡洋，唐洲平

MicroRNA对间充质干细胞免疫功能的调节

胡洋，唐洲平

间充质干细胞（MSCs）是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的干细胞，能分泌多种生长因子，细胞因子和免疫调节因子，在组织损伤及炎性疾病的修复中发挥重要的免疫抑制作用。MicroRNA是一类非编码单链小RNA分子，调控细胞增殖、分化、凋亡以及机体免疫系统应答。MSCs中的MicroRNA分子可直接改变免疫调节因子分泌量，或间接作用于炎症相关信号通路来改变MSCs的免疫调节功能。本综述对MicroRNA对间充质干细胞免疫功能的调控做一概述。

间充质干细胞；MicroRNA；免疫调节

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的非造血干细胞，来源于中胚层体发育早期的中胚层和外胚层，表达CD29、CD44、CD90、CD105及CD73表面标志物，不表达CD14、34和45等造血细胞表面标志物[1]。30多年前，Friedenstein等[2]首次从骨髓中分离纯化得到MSCs，后相继在脂肪、牙髓、绒毛、大脑、心脏、皮肤和脐血等器官组织中发现其存在。体外培养因形态酷似成纤维细胞且能贴壁生长与其它细胞相区分。在体外特定培养条件的诱导下，MSCs不仅能分化成同胚层的骨骼、脂肪和软骨细胞，还能跨胚层分化为内胚层的神经或者心肌细胞等。且能够分泌多种生长因子、细胞因子、胶原和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等，促进组织损伤的修复[2-4]。

在体内与体外的免疫调节作用是MSCs又一重要功能。MSCs广泛调控着参与固有免疫和适应性免疫反应的效应细胞，可分泌可溶性因子作用于靶细胞或与靶细胞直接接触抑制其免疫应答，目前已证实的可溶性因子主要有前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、肿瘤坏死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等[5,6]。MSCs阻滞自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）和树突细胞的生长，抑制主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）错误匹配的淋巴细胞的增殖，阻断T、B细胞和naïve T的生长与活化。MSC分泌的IDO分子是催化色氨酸分子中吲哚环氧化裂解、沿犬尿酸途径进行分解代谢的限速酶，能降解T细胞代谢必须的亮氨酸，抑制T细胞的免疫应答；分泌的PGE2分子将促炎型的M1型巨噬细胞部分转变成抗炎M2型，也能重编程巨噬细胞增加其抗炎细胞因子白细胞介素（interleukin， IL）10的释放；分泌的TSG6分子能与巨噬细胞表面CD44结合，抑制TLR2/NFκB信号通路的激活，减少下游炎症因子的释放，减弱炎症反应[7,8]。

MSCs的免疫调节能力因种属和组织来源的不同而异。在相同培养条件刺激下，灵长类动物骨髓来源的MSCs主要分泌IDO抑制T细胞应答；但鼠类MSCs主要释放NO，其IDO分泌水平极低。马的脂肪来源的MSCs比脐带血和骨髓来源的MSCs分泌的NO量低很多。同样，比起骨髓来源的MSCs，人脐带血来源和羊膜组织来源的MSCs在免疫调节能力上更为相似，但在基因表达有明显的个体差异性，脂肪组织来源的MSCs表达更丰富的免疫调节相关基因[9,10]。

MSCs在炎症环境或炎症因子如干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）联合肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α或IL1β的刺激才能显现出免疫调节能力，炎症反应越强烈MSCs的抗炎能力也更强，对炎症愈合与减弱期的调节作用往往不如急性期，且MSCs移植同时服用抗炎药物地塞米松治疗炎性疾病会大大衰弱前者的抗炎能力，因此MSCs调节炎症反应的同时也被环境中的炎症因子所调控，二者密不可分[11]。

MicroRNA是非编码单链RNA分子，由19～25个核苷酸组成，能与mRNA 3’端非翻译序列靶向互补结合，结合后的MicroRNA可直接裂解mRNA，也可通过脱腺苷化作用降解mRNA，抑制mRNA的翻译，最终下调目的蛋白的合成，机体约60%的mRNA受MicroRNA调控[12]。MicroRNA经典的合成过程如下：在细胞核，由编码基因转录得来的primiR在Drosha（核酸酶III，Rna酶III）和DGCR8共同作用下裂解成短的双链茎环状前体分子，即pre-miR，pre-miR随后由Exportin5携带进入细胞质，被胞质内的Dicer（另一种RNA III酶）和RNA结合蛋白组成的复合物裂解，形成一段由2个成熟miR序列（方位分别是5p和3p）组成的长约22 nt的双链MicroRNA，其中一条链不稳定易降解，残留下来较稳定的单链即成熟MicroRNA。成熟的MicroRNA能够抑制mRNA编码的蛋白翻译，在病毒、植物和动物间高度保守[13,14]。

MicroRNA的检测方法目前有MicroRNA芯片和高通量测序2种，前者灵敏度较低，易出现假阳性，检测效能也较低下。相比而言，高通量测序结果更为准确可靠，能精确检测出组织特异性的MicroRNA分子，发现未知的MicroRNA，但成本往往比芯片高。目前为止，已检测出3000多种MicroRNA分子，至少有300种属于人类基因组。其进化高度保守，有精确的进化模式和细胞特异性的表达谱[15]。

MicroRNA对细胞分化、增殖、凋亡、遗传调控、胰岛素分泌、肿瘤发生发展及固有免疫、适应性免疫应答有重要的调控作用，其中涉及到一系列信号通路及通路上的效应分子；反之，活化的信号通路尤其是细胞核内通路也能干扰MicroRNA的表达，二者相互作用。如IL-1β/NFκb通路激活能够上调细胞核内pri miR146a的合成，加工后成熟的miR 146a进入胞质后反过来抑制NFκb通路上游IRAK1和TRAF6蛋白合成，抑制NFκb信号通路过度活化[16]。

MSCs中也有含量丰富的Micro RNA，这些小分子也调控着MSCs的分化，自我更新和免疫调节功能。沉默Dicer和Drosha后，MSCs的成骨及成脂分化能力被抑制，首次发现了MicroRNA对MSC分化能力的调控。参与免疫调节的MicroRNA由MSCs直接分泌，或者包含在微粒或外泌体中运输到细胞外，与靶细胞结合后施展作用。在众多的MicroRNA中，miR146a，miR155和miR181a与炎症调控的研究较为成熟，对间充质干细胞的调控也已被证实[17]。

miR146家族包含miR146a和miR146b 2个成员，前者与肿瘤发生及炎症关系更为密切，能够调节免疫细胞的信号通路，影响细胞的活化与增殖状态，抑制固有免疫和适应性免疫应答，是重要的抗炎小分子。miR146a能抑制重要炎症通路--NFκb通路上下游诸多效应分子，肺纤维化时NF κb非经典通路上的RelB分子通过miR146a调节IL-1诱导产生的炎症介质[18]。在间充质干细胞中miR-146a-5p直接作用于IKK（NFκb通路激活酶复合物）的抑制因子SIKE1。而miR146a的产生也依赖于NFκb的激活，当环境中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、TNFα和IL-1β与细胞上的toll样受体TLR2、4、5结合后启动下游信号通路如NFκb通路的激活，miR146a的表达会随之迅速上调，而上调的mi146a又反过来抑制通路上的效应分子来衰弱炎症反应[11]。

Matysiak等从小鼠骨髓中分离出新鲜的MSCs并在体外向神经干细胞诱导分化（nMSCs），诱导前和诱导后的细胞移植治疗实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠模型，发现后者的疗效远不如前者，PCR和ELISA检测结果表明nMSCs的环氧化酶（cyclooxygenase，COX）2表达水平以及PGE2分泌量均低于MSCs，且差异具有统计学意义，进一步的MicroRNA表达谱测序结果分析显示nMSCs中miR146a表达水平较MSCs上调，双荧光酶报告基因实验验证了miR146a能与COX2 3’端靶向结合，抑制COX2蛋白翻译，最终降低PGE2的分泌，故诱导后的细胞免疫调节能力下降系细胞内miR146a上调所致。同样，当骨髓来源的MSCs诱导分化成肺上皮样细胞时，在TNFα刺激下，IL8的释放水平诱导后较诱导前下降，下降幅度与miR146a的下降呈正相关[19]。MSC移植治疗糖尿病患者伤口，MSC能够上调创口周围miR146a，阻滞NFκb通路上游的激活因子IRK1和TRAF6的合成，还能减弱炎症因子IL-6和MIP2的释放，抑制伤口周围的炎症反应，促进伤口修复。综上所述，MSCs的免疫调节功能与miR146a密不可分，与NFκb通路的相互作用值得进一步研究[20]。

除miR146a之外，另一个重要的调控分子是miR155。最初报导造血细胞中miR155升高时会引起血液系统恶性肿瘤，如B细胞淋巴瘤和急性髓系白血病，后发现miR155也调控着固有免疫应答和适应性免疫应答[21]。病毒感染后，环境中产生的IFNα、IFNβ与巨噬细胞表面Toll样受体3（TLR3）结合，上调细胞内miR155的表达。树突细胞miR155上调能抑制Arg2的表达，降低精氨酸的合成量，阻碍T细胞活化[22]。除此之外，miR155还能通过影响T细胞免疫应答增加EAE的感染几率，也是MS治疗的潜在靶点。在naïve T细胞中干扰miR-155的表达促进Th2细胞生长，产生大量Th2型细胞因子如IL-4，IL-5和IL-10等[23]。

IFN γ联合TNF α刺激骨髓来源的MSCs后，细胞诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达增加，伴随着miR155的上调，双荧光酶报告基因实验证实miR155结合于TAB2 3’端未翻译序列（炎症因子和NF κb信号通路）间接干扰iNOS的合成，最终减少NO释放，减弱MSC的免疫调控能力[24]。将MSCs和Wistar大鼠的心脏联合移植到SD大鼠体内，miR155表达下降，TH1类免疫反应逐渐向TH2型转变，且Treg细胞增多，免疫排斥反应减弱，使移植后的心脏存活时间延长[25]。总之，miR155会抑制MSCs对炎症反应的调节能力。

miR181a也是重要的炎症调控分子，在骨髓和胸腺中表达量很丰富，对T和B细胞的发育有着重要作用，miR-181a能调节T细胞的敏感性，还能影响T细胞在胸腺发育过程中的阴性和阳性选择，下调多种磷酸酶，增加稳定的磷酸化中间产物，降低TCR信号活化的阈值，促进TCR信号活化[26]。

miR181a在MSCs中起的调控作用尚未清楚阐明，人类脐带血和胚胎组织来源的MSCs在IFNγ刺激时，高表达的miR181a能够下调TGFBR1和TGFBRAP1，抑制TGFβ信号通路的激活，同时上调P38和JNK信号通路，增加IL-6和IDO的分泌，促进MSCs的免疫调控能力[27]。

除此之外，Castillo等[28]用IFNγ刺激MSCs来源的神经元时，原本在MSCs中表达量极低的MHCII类分子重新高表达，且与T细胞共培养后诱导后的细胞会增加致炎递质P物质（substance P，SP）的释放，几乎失去MSCs的免疫调节能力，可能与诱导后的细胞miR206和miR130a的表达下降有关系。

综上所述，MicroRNA分子与MSCs的功能密不可分，调控MSCs免疫功能的microRNA也是在适应性免疫应答和固有免疫应答中发挥重要作用的小分子，虽然参与调节的MicroRNA种类复杂，调节的细胞机制各异，但总结主要有如下3种方式：①上调或下调MSCs自身的MicroRNA，这些改变的MicroRNA能够直接或间接作用于合成免疫因子的酶如COX2、iNOS等来影响MSCs免疫调节因子的分泌量；②MSCs通过外泌体或微粒分泌MicroRNA到细胞外，直接作用于免疫细胞，改变细胞内信号转导，调控细胞的作用和效应；③MSCs与靶细胞接触作用后引起靶细胞内MicroRNA的变化，随之改变靶细胞内蛋白的合成，间接调节免疫反应。目前关于MicroRNA与MSCs免疫调节能力的研究报道仍然不多，动物实验较欠缺，最终用双荧光酶报告基因实验验证MicroRNA分子靶向结合mRNA的实验更少，这也为我们后续的研究提供了思路和需要探索的方向。认清了这些MicroRNA分子后，我们可以在体内或体外改变其表达量来修饰MSCs的免疫调控能力，为MSCs治疗炎症疾病的临床应用奠定更坚实的基础。

[1]Caplan AI,Correa D.The MSC:an injury drugstore[J].Cell Stem Cell,2011,9:11-15.

[2]Friedenstein AJ,Chailakhyan RK,Gerasimov UV.Bone marrow osteogenic stem cells:in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers[J].Cell Tissue Kinet,1987,20: 263-272.

[3]朱青,汪晶,刘元渊,等.脊髓损伤的病理机制和细胞移植治疗进展[J].神经损伤与功能重建,2013,8:217-220.

[4]Uccelli A,Moretta L,Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health and disease[J].Nat Rev Immunol,2008,8:726-736.

[5]Ohtaki H,Ylostalo JH,Foraker JE,et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses[J]. ProcNatlAcadSciUSA,2008,105: 14638-14643.

[6]Ren G,Zhang L,Zhao X,et al.Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide[J].Cell Stem Cell,2008,2:141-150.

[7]Lee RH,Pulin AA,Seo MJ,et al.Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6[J]. Cell Stem Cell,2009,5:54-63.

[8]Németh K,Leelahavanichkul A,Yuen PS,et al.Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production[J].Nat Med,2009,15: 42-49.

[9].Ren G,Su J,Zhang L,et al.Species variation in the mechanisms of mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression[J].Stem Cells, 2009,27:1954-1962.

[10]Wegmeyer H,Bröske AM,Leddin M,et al. Mesenchymal stromal cell characteristics vary depending on their origin[J].Stem Cells Dev, 2013,22:2606-2618.

[11]Crop MJ,Baan CC,Korevaar SS,et al.Inflammatory conditions affect gene expression and function of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].Clin Exp Immunol, 2010,162:474-486.

[12]Zamore PD,Haley B.Ribo-gnome:the big world of small RNAs[J].Science,2005,309: 1519-1524.

[13]Yang JS,Maurin T,Lai EC.Functional parameters of Dicer-independent microRNA biogenesis[J].RNA,2012,18:945-957.

[14]Stewart CR,Marsh GA,Jenkins KA,et al. Promotion of Hendra virus replication by microRNA 146a[J].J Virol,2013,87:3782-3791. [15]Hsieh JY,Huang TS,Cheng SM,et al. miR-146a-5p circuitry uncouples cell proliferation and migration,but not differentiation,in human mesenchymal stem cells[J].Nucleic Acids Res,2013,41:9753-9763.

[16]Ma X,Becker Buscaglia LE,Barker JR,et al.MicroRNAs in NF-kappaB signaling[J].J Mol Cell Biol,2011,3:159-166.

[17]Lee HK,Finniss S,Cazacu S,et al.Mesenchymal stem cells deliver exogenous miRNAs to neural cells and induce their differentiation and glutamate transporter expression[J].Stem Cells Dev,2014,23:2851-2861.

[18]Dong S,Xiong W,Yuan J,et al.MiRNA-146a regulates the maturation and differentiation of vascular smooth muscle cells by targeting NF-kappaB expression[J].Mol Med Rep, 2013,8:407-412.

[19]Matysiak M,Fortak-Michalska M,Szymanska B,et al.MicroRNA-146a negatively regulates the immunoregulatory activity of bone marrow stem cells by targeting prostaglandin E2 synthase-2[J].J Immunol,2013,190:5102-5109.

[20]Xu J,Wu W,Zhang L,et al.The role of microRNA-146a in the pathogenesis of the diabetic wound-healing impairment:correction with mesenchymal stem cell treatment[J].Diabetes,2012, 61:2906-2912.

[21]Thai TH,Patterson HC,Pham DH,et al. Deletion of microRNA-155 reduces autoantibody responses and alleviates lupus-like disease in the Fas(lpr)mouse[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110:20194-20199.

[22]Dunand-Sauthier I,Irla M,Carnesecchi S,et al.Repression of arginase-2 expression in dendritic cells by microRNA-155 is critical for promoting T cell proliferation[J].J Immunol,2014, 193:1690-1700.

[23]O’Connell RM,Kahn D,Gibson WS,et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development[J].Immunity,2010,33:607-619.

[24]Xu C,Ren G,Cao G,et al.miR-155 regulates immune modulatory properties of mesenchymal stem cells by targeting TAK1-binding protein2[J].JBiolChem,2013,288: 11074-11079.

[25]Huang H,He J,Teng X,et al.Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiacallograftassociatedwithdecreasein miR-155 expression[J].J Surg Res,2013,185: 896-903.

[26]Chen CZ,Li L,Lodish HF,et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation[J].Science,2004,303:83-86.

[27]Liu L,Wang Y,Fan H,et al.MicroRNA-181a regulates local immune balance by inhibiting proliferation and immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2012,30:1756-1770.

[28]Castillo MD,Trzaska KA,Greco SJ,et al. Immunostimulatory effects of mesenchymal stem cell-derived neurons:implications for stem cell therapy in allogeneic transplantations[J].Clin Transl Sci,2008,1:27-34.

（本文编辑：唐颖馨）

R741；R741.02

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.015

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科
武汉430030

国家自然科学基金（No.81171089）

国家自然科学基金（No.81471201）

武汉市科技局项目（No.2013060602010 240）

2015-02-27

唐洲平

ddjtzp@163.com