金洪波 毕生雷 乔建援 刘 钺 杜风光 郝生印

（河南天冠企业集团有限公司，河南 南阳 473000）

生物柴油是一种优质清洁柴油， 原料可以从各种含油生物中获得，可以说是取之不尽、用之不竭的能源。 生物柴油具有环保、安全、可降解、可再生以及燃烧性能优良等优点，在资源日益枯竭的今天，在能源领域拥有重要的地位和广阔的发展前景， 有望取代石化柴油成为替代燃料。

据报道，2013年中国有近300 万吨的生物柴油产能，但是由于原料短缺，实际产量还不足90 万吨。 因此原料短缺严重制约了生物柴油产业的发展。

产油微生物是上世纪50年代兴起的研究热点，它的优势在于培养周期比较短，正常情况下，产油微生物生长周期仅3-20 天，产油微生物胞内优质含量高达50-80%，占地面积相对传统产油原料来说要少得多。 作为异养产油微生物的代表， 华东理工大学的李元广团队培养的小球藻终了生物量可以达到144g/L， 中科院大连化物所的赵宗保团队培养的圆红冬孢酵母终了生物量更是高达180g/L 以上。 产油微生物的产率高、油脂含量高、生长周期短、占地面积较少的优点赢得了广大研究人员的关注。

天冠集团与清华大学、中科院大连化物所合作，进行了异养小球藻和圆红冬孢酵母发酵法制备生物柴油原料的实验[1-2]，在实验过程中，课题组发现使用发酵法培养具有明显的比较优势。 本文着重分析了产油酵母的一些优势和发酵中出现的问题。

1 产油酵母发酵具备的一些优势

1.1 发酵中的原料成本较低

圆红冬孢酵母相对其他产油脂的的发酵过程来说具有一定优势，酵母细胞中含油量高（高达60%-70%），而且产油酵母转化率高（葡萄糖/干粉转化率可达50%，葡萄糖/油脂转化率可达30%），因此生产相同数量的油脂需要培养基原料、发酵过程中补料相对较少。 而且产油酵母发酵过程所用的原料比较单一，仅葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等四五种， 远远低于其他产油微生物培养所需要的原料种类[3]。 中科院大连化物所的研究成果还表明，圆红冬孢酵母可以利用菊芋、秸秆等廉价原料，而且生产效率与葡萄糖等高价值原料相差无几。 这些都使得原料成本相对较低。

1.2 发酵中的能耗成本较低

圆红冬孢酵母的生长速度较快， 相对其他产油脂的发酵过程来说，在发酵周期方面，圆红冬孢酵母由于每天干重增加量高（每天干重增加量可以达到15-20g/L*D），而其他产油微生物一般在异养培养条件下每天干重增加量仅4-9g/L*D，在自养条件下每天干重增加量还不足2g/L*D，生产效率提高了近10 倍。因此生产相同数量的油脂需要的发酵时间相对较短。 对于自养发酵来说，培养时间缩短，那么通入二氧化碳所需要的泵、压缩机的耗电量就少，对于异养发酵来说，培养时间缩短，那么通风量、搅拌耗电量都会大大缩短。 因此培养时间缩短意味着消耗的电、风、水均相对减少。 同时，在圆红冬孢酵母的培养过程中，异养培养是产热的过程，而其他自养产油微生物在培养过程中，为了保持环境中温度和湿度的恒定，往往需要使用外在热源升温， 这意味着产油酵母异养培养过程与其他自养产油微生物相比节省了大量的加热成本。

1.3 控制条件宽松，利于工业生产

圆红冬孢酵母在发酵过程中对葡萄糖的耐受范围宽，最高浓度高达15%，作为工业化生产，可以一次补料到10%以上，从而2-3 天补料一次即可。 较高的葡萄糖耐受范围可以使培养过程补料的次数减少， 而其他产油微生物在发酵过程中， 一般来说耐受葡萄糖浓度最高仅6%。超过最高浓度，将抑制微生物的正常生长和产油的效率。 另外，圆红冬孢酵母生长比较迅速，在24 小时即可形成种群优势， 其他产油微生物往往需要培养6 天以上才能获得比较明显的种群优势，与其他产油微生物相比，染菌机率明显降低， 对普通工人的操作水平的要求也相对较低。 因此发酵操作相对宽松，意味着生产管理更适合普通工人操作。

1.4 染菌机率较低

圆红冬孢酵母在短期内获得了种群优势， 使得除霉菌外其他杂菌影响圆红冬孢酵母生长、 产油的概率几乎为零。 其他产油微生物在自养条件下，由于培养液中营养丰富，容易受到虫子、细菌的污染，从而影响产油微生物的正常生长以及烘干以后干粉的品质。 其他产油微生物在异养条件下， 由于需要较长的时间才能完成细胞数量的积累，因此在获得种群优势之前极易受到细胞、霉菌、酵母菌的污染，一旦发酵液受到污染，由于产油微生物获得营养物质的能力弱于杂菌、生长速度弱于杂菌，会出现细胞浓度生长停滞、胞内油脂含量下降等问题。

2 发酵过程染菌问题初探

摇瓶试验与发酵罐中培养有较大的差别。 首先，发酵罐中培养时只能使用摇瓶接种或者上一级种子罐接种，为了减少生产成本， 种子罐的放大梯度一般仅为10 倍，因此接种量没有办法像摇瓶培养一样达到20%甚至50%的接种量。 其次， 摇瓶中溶解氧的获得主要依赖摇床摇动，使环境中氧气溶解到培养基中。 而在室温下物料的溶解氧数量比较有限， 因此摇瓶培养过程中圆红冬孢酵母细胞获得的溶解氧数量有限，影响了生长速度。 最后，摇瓶生长环境比较封闭，为了保证种子培养效果，摇床一般会放置到无尘室内， 因此圆红冬孢酵母在培养过程中受到污染的概率极低。 为了探讨圆红冬孢酵母异养培养的生长特性， 本课题组先后进行了50 升小试和1500 升中试， 在发酵过程中，50 升小试和1500 升中试出现了一些不同的问题，针对这些问题本课题组做了初步分析，并提出了相应的解决方法。

2.1 50 升小试

按标准配方进行发酵， 出现了前期酵母细胞数增长较慢的现象，结果是较少的细胞浓度增殖速度较慢，并且在整体上拉长发酵周期，造成电、风的消耗增加。 针对这一现象分析原因可能是以下几点。

一是发酵接种量稍低。 对于50 升发酵来说，初始培养基一般为30 升，接种500 毫升种子接种量低，仅有1/60，初始细胞浓度较低使发酵生长缓慢。 因此，为了缩短发酵周期需要提高接种量， 具体做法就是减小初始培养基的体积，以期在种子数量不变的情况下提高接种量。

二是发酵底料中初始糖浓度太高。 细胞接到发酵罐中以后需要有一个适应阶段，因此出现了近16 小时的生长停滞期。 发酵初期圆红冬孢酵母种群不占优势，为了减少补料引起的染菌，减少补料次数，在发酵培养基里初始糖浓度比较高。 圆红冬孢酵母种子在摇瓶中培养结束时糖含量基本为1%左右， 而到了发酵罐中糖含量高达10%，渗透压的剧烈变化影响了产油酵母的正常生长。 解决的办法就是降低发酵底料初始糖浓度， 将初始糖浓度降低到3%，然后将补料时间由第4 天提前到第2 天。 这样做虽然在第2 天， 圆红冬孢酵母细胞数量还没有达到绝对优势， 但是在对数生长期圆红冬孢酵母细胞数量通常在10 亿/毫升，而且增值迅速，能够避免受到污染。

三是发酵中后期，干物质增加缓慢。 造成这种现象的原因主要是发酵底物浓度和发酵液体积增加过快， 圆红冬孢酵母在生长过程中油脂积累速度较快， 因此为了维持正常的葡萄糖含量，每天需要补料1-2 升。 但是补料时使用的葡萄糖的浓度仅仅为50%左右， 不断的补料造成发酵液体积增加，而发酵稳定期，圆红冬孢酵母主要是积累胞内油脂数量，细胞增殖极慢。 补料体积增加较快、圆红冬孢酵母酵母数量增加较慢， 导致补料相对稀释了酵母细胞的数量。 解决的办法是，减小初始培养基的体积，以腾出空间补料和提高初始的接种量。 另外，发酵底物中除氮源浓度以外，其他如碳源和微量元素等，胞内需要保持在一定的浓度， 以刺激产油酵母的细胞增殖和油脂生成。 关于补料，需要注意的是碳源在溶解过程中，水的添加以能溶解碳源为标准，不需要添加太多的水，否则会造成发酵液体积增长过快，终了干物质含量上不去。

2.2 1500 升中试

50 升发酵是介于实验室研究和工业生产之间的阶段，可以探讨实验室研究在工业生产中应用的不足，也可以寻找相应的解决方案。 但是50 升发酵是一个相对孤立的发酵过程，不能够连续生产，因此仍然需要开展中试来进一步放大发酵试验， 以发现发酵过程中有可能影响工业化的问题。

2.2.1 碱管堵塞

发酵过程中，出现过加碱系统不锈钢管道堵塞现象。原因是： 为了保证发酵过程不染菌， 罐压需要维持在0.1mpa 左右。 碱液浓度一般配40%， 接近溶解度的临界点。 在流加的时候，如果风压有波动，导致罐压较高，碱液会在流加管中析出， 从而堵塞流加管。 或者外界温度较低，碱液在较低的溶解度下析出颗粒状物质，久而久之就会堵塞流加管道。

出现这种现象主要从两方面解决， 一是尽量使用配好的碱液的上清部分，沉淀的杂质舍去不用。 批量采购的工业级氢氧化钠中通常有一定的杂质， 在配成碱液并降温至室温后，会有一些不溶性物质析出，这些低溶解度的物质如果被蠕动泵碱流加压到流加管中， 有可能在某些管道拐弯处沉积下来。 二是尽量使用30%左右浓度的碱液，这样就会避免天气温度变化造成碱溶解度不同。 碱液浓度降低，会相应增加将pH 调节到正常水平所消耗的碱液体积，但是正常情况下，发酵过程中消耗碱液仅占总补料体积的十分之一，对整个发酵过程影响极小。 三是将罐压降低到0.08mpa 左右， 罐压的降低有可能增加染菌的机率，但是在保持正压的条件下，染菌机率还是相对较低的。

2.2.2 染菌

染菌是发酵过程中一种比较普遍的现象。 出现染菌的原因主要有：风压波动较大，引起进风口、排风口倒吸，补料过程操作不严谨带入细菌。 染菌以后通常做法是立即高温灭菌，并对环境反复消毒，这样做结果是浪费前期投入的培养基、补料，以及过程中消耗的能源。 为了避免发生染菌现象， 综合考虑1500 升每次出现的染菌时间，染菌后出现的现象，以及发酵平台当时的其他操作等，我们大致总结出以下几点注意事项。

一是，风系统中主渠道与分管道的配比是否合适，如果使用风的设备较多，主渠道就要相应粗一些，且单台设备应当配置单独的进风管道和排风管道， 这就不会导致单台设备用风量较大时，其他设备风压波动较大。 通常情况下，为了保持现场的美观，在生产车间往往将多台发酵罐的排风管道和进风管道合并在一起。 这种布局正常情况下不会出现问题， 但是如果出现风压大幅波动或者风压归零的情况， 极有可能引起杂菌通过管道被倒吸进发酵罐中。 另外，多台发酵罐的排风管道和进风管道合并在一起，也不利于在发酵罐实消阶段彻底杀菌。

二是，风压是否合适，不能太低，以免多个设备同时用风时造成风压波动太大。 如果保持0.05mpa 以上的压力，风压即使保持波动也能维持在正压的范围内。 而罐压低于0.05mpa，如果风压波动较大，或者是空气压缩机、风管道出现问题，有可能使罐压在某个时间段内为零，从而导致外界细菌进入到发酵罐内，造成污染。

三是，在前两点的前提下，要注意操作其他设备对正在发酵的设备的风压波动的影响。 在生产车间里，管道上的阀门比较大， 操作人员往往使用加力杆来开启和关闭阀门，结果是阀门往往被快速开启或关闭，引起其他用风管道的压力大幅波动。 如果管道设置不当，再加上系统风压剧烈波动，就会引起染菌。

四是，无论操作多么完善，也不可能比得上无尘室的环境，而且在无尘室中也会染菌。 因此在生产车间，要时刻防止染菌，在染菌以后应当及时挽救。 从目前的研究成果来看，可以通过添加青霉素等抑菌剂，破坏杂菌的细胞膜合成，抑制杂菌的生长。 而产油酵母的生长虽然不能和正常发酵过程相媲美， 但是仍然能够达到一个较高的水平，从而减少因为染菌而造成的物料和能源消耗。 课题组在染菌后加入500ppm 的青霉素取得了较好的效果，能够保证实验顺利进行下去。

3 结论

微生物发酵法制备生物柴油原料具有较多优势，是生物能源领域重要的组成部分，但是作为一种新生事物，还需要不断完善。 生产企业应不断完善生产系统，以满足产油微生物生长的需求。 研究人员需要不断尝试，筛选新的菌株、开发更贴近生产应用的原料，还需要开发新的工艺以提高生产效率、降低成本，使微生物发酵制备生物柴油早日实现工业化。

［1］毕生雷，张成明，李十中，等.异养小球藻半连续发酵生产油脂工艺探讨［J］.食品与发酵科技，2014（05）:36-40.

［2］毕生雷，乔建援，刘钺，等.异养小球藻用发酵罐的使用与维护［J］.化学工程与装备，2014（07）:64-65.

［3］马勇，图雅，刘晓光等.产油酵母菌高产培养基的营养成分优化［J］.湖北农业科学，2013，52（23）:5832-5835.