朱在卿，许贵刚，郭艳丽，马 斌，卢 岩

针刺干预对脑缺血大鼠脑组织低氧诱导因子-1α蛋白和mRNA表达的影响

朱在卿1，许贵刚1，郭艳丽1，马 斌1，卢 岩2

目的 观察针刺干预对脑缺血大鼠脑组织缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白及mRNA表达的影响，探讨针刺对缺血性脑血管疾病的防治机制。方法 建立局灶性脑缺血大鼠模型，随机分为正常组、假手术组、模型组、针刺组(各8只大鼠)，应用蛋白印迹及实时荧光定量检测针刺对局灶性脑缺血大鼠脑组织HIF-1α蛋白及mRNA表达的变化。结果 正常组和假手术组大鼠比较HIF-1α蛋白及mRNA表达无明显变化，模型组大鼠HIF-1α蛋白及mRNA表达上调，差异无统计学意义;针刺组大鼠HIF-1α蛋白及mRNA表达高于模型组(0.567±0.058vs0.315±0.118; 1.593±0.102vs1.193±0.259)，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 脑缺血后大鼠脑组织HIF-1α蛋白及mRNA表达增强，针刺可以上调其表达从而发挥脑保护作用。

局灶性脑缺血；针刺；缺氧诱导因子-1α

缺血性脑血管病是常见病、多发病，如何减轻脑缺血后脑组织损伤，提高神经元对缺血缺氧的耐受，是目前研究的热点。低氧诱导因子-1 α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)可通过对靶基因的诱导表达，调控机体产生一系列适应低氧反应的变化。因此，笔者从电针干预大鼠脑缺血后HIF-1α蛋白及mRNA表达的研究入手，为针刺治疗缺血性脑血管病的机制研究探索新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性大鼠[Wistar，SPF级，(220±20) g]32只[购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001]。在室温25℃左右、相对湿度为40%～60%条件下适应性饲养3 d后开始实验。整个实验过程符合动物伦理学标准。

1.2 实验仪器 江湾Ⅰ型C立体定位仪(上海川沙花木农机厂)、韩氏疼痛治疗仪(南京济生医疗科技有限公司)、光学显微镜(奥林帕斯BX51，日本)、qPCR仪(7500 Fast，Applied biosystems，USA)、电泳仪(BIO-Rad，美国)、凝胶成像仪(2500，Tanon公司)、TRIzol Reagent(15596-018，Invitrogen公司)、superscript Ⅲ反转录试剂盒(18080-044，Invitrogen公司)。

1.3 造模方法及针刺处理 大鼠随机分为模型组、针刺组、正常组和假手术组，每组各8只大鼠。针刺组和模型组大鼠采用线栓大脑中动脉(MCAO)复制局灶性脑缺血大鼠模型，模型制作方法根据文献[1,2]方法并结合本实验室操作的经验进行改良。假手术组除了不插入线栓，其他与模型复制手术过程相同，正常组大鼠不予任何手术操作。造模后大鼠参照Zea Longa的神经体征评分方法[3]评价MCAO大鼠运动功能。无神经缺损体征为0分；不能充分屈曲左侧前爪为1分；向左侧转评为2分；可向左侧倾倒为3分；不能自发行走，并意识丧失为4分，评分1～3分为模型制作成功。

针刺组大鼠分别取双侧“曲池”和“内关”穴进行针刺。穴位定位参照中国针灸学会实验针灸研究会研究制订的实验动物穴位定位标准及拟人对照法定位[4]：内关穴定位于前肢内侧，距腕关节约3 mm处的尺桡骨缝间，曲池定位于桡骨近端，肘关节外前方的凹陷中。将大鼠固定在自制的固定器上，内关穴直刺1 mm，曲池穴直刺4 mm，连接韩氏疼痛治疗仪，采用2/15 Hz的疏密波，刺激电流为1 mA，留针20 min，1次/d，连续针刺7 d。

1.4 脑组织的制备及HIF-1α的检测

1.4.1 脑组织的制备 实验结束后，大鼠麻醉后(n=5)用生理盐水经左心室升主动脉灌注，然后用4%多聚甲醛溶液(pH7.4)缓慢灌注固定，取脑。于大脑中动脉起始处向后取约1 cm厚的冠状面脑片，投入4%多聚甲醛溶液固定，脱水，透明、浸蜡，石蜡包埋，切片5 μm。大鼠(n=3)麻醉后，直接在冰盘上快速取脑，同样于大脑中动脉起始处取约8 mm的缺血侧脑组织，分为二等份，称重后于-80 ℃冰箱中保存，分别进行HIF-1α蛋白和 mRNA的检测。

1.4.2 组织病理学检查 石蜡切片经过二甲苯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ脱蜡， 95%，90%和70%的梯度乙醇脱水，HE染色，在显微镜下观察缺血侧脑组织的变化。

1.4.3 蛋白质印迹(Western Blot) 将各组大鼠脑组织加入RIPA裂解液，进行提取总蛋白。经过12%SDS-PAGE胶电泳，然后再经过转膜、杂交和曝光。应用Quantity One软件对蛋白条带灰度进行分析，以β-actin作为内参。

1.4.4 实时荧光定量[Real-time Quantitative PCR Detecting System (QPCR) ] 取大鼠脑组织，用Trizol(Invitrogen)提取总RNA，采用superscript Ⅲ反转录试剂盒反转录合成cDNA。ABI 7500 Fast进行HIF-1α扩增，扩增体系包括：cDNA 1 μl，10X Buffer 2 μl，Mg2+1 μl，Primer-F(10 μM) 1μl，Primer-R(10 μM) 1μl，Sybgreen(20X) 1 μl，ddH2O 12.8 μl，Taq 0.2 μl，于ABI 7500 Fast qPCR仪上反应。由Primer Premier 5.0软件(Premier公司，加拿大)设计引物，HIF-1α(NM_024359.1)引物序列为 F-CTGTGGGGTTTCGTTTCTGT, R-GGACAAACTCCCTCACCAAA。ABI 7500 Fast自带系统软件分析实验结果，计算mRNA的相对表达量。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计分析软件，针刺治疗前后组内比较采用t检验，针刺治疗后各组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者用LSD法，方差不齐者用Tamhan T2法进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 针刺对MCAO大鼠神经功能的影响 正常组和假手术组大鼠饮食正常，活动自如，毛色有光泽，神经体征无异常。模型组大鼠进食量及体重明显下降，毛色晦涩，不能完全伸展对侧前肢，提尾倒立时身体弯向对侧，前肢下垂等。针刺组上述脑缺血的神经运动功能明显恢复。采用神经体征评分评价运动功能恢复的程度，模型组大鼠神经体征评分均高于正常组和假手术组，表明模型组大鼠运动功能存在缺损。针刺组大鼠神经体征评分低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明针刺组大鼠运动功能恢复显著(表1)。

表1 针刺对MCAO大鼠神经体征评分的影响 (分

注：与正常组比较，①P<0.05；与假手术组比较，②P<0.05；与模型组比较，③P<0.05；与治疗前比较，④P<0.05

2.2 脑组织大体及镜下改变 正常组及假手术组大鼠脑组织外观正常，无明显变化。HE切片未见明显组织病理改变，大脑皮质及海马区的神经细胞层次清晰，大小正常，形态完整，神经细胞及毛细血管周围间隙正常，未见梗死区。模型组大鼠脑组织呈现不同程度的萎缩、液化及坏死，脑皮质可见大片的梗死区，细胞排列不规则间隙疏松，大量胶质细胞及血管增生，部分大鼠海马区锥体细胞核固缩坏死，甚至片状消失。针刺组大鼠神经坏死数量减少(图1)。

图1 大鼠海马病理改变(×100, HE染色)

2.3 针刺对MCAO大鼠缺血脑组织中HIF-1α的影响 结果显示，假手术组大鼠脑组织HIF-1α蛋白和mRNA的表达与正常组比较，差异无统计学意义；模型组大鼠脑组织HIF-1α蛋白表达上调，但与正常组和模型组比较差异无统计学意义。模型组大鼠脑组织HIF-1αmRNA的表达上调，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；针刺组大鼠脑组织HIF-1α蛋白和mRNA的表达上调，显著高于模型组、正常组和假手术组，差异有统计学意义(P<0.05，表2，图2)。

组别HIF-1α蛋白表达相对定量值HIF-1αmRNA2-△△Ct值正常组0.278±0.1571.000±0.000假手术组0.221±0.1400.932±0.075模型组0.315±0.1181.193±0.259②针刺组0.567±0.058①②③1.593±0.102①②③

注：与正常组比较，①P<0.05；与假手术组比较，②P<0.05；与模型组比较，③P<0.05

图2 各组大鼠缺血侧脑组织HIF-1α的蛋白表达

3 讨 论

缺血缺氧性脑血管疾病是导致人类致死、致残的重要原因，其发病率呈逐年升高的趋势，严重威胁着人类的健康。针刺具有明确的保护脑缺血后神经细胞的作用[5]，低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor -1α，HIF-1α)作为关键的缺氧感受因子，参与了脑缺血缺氧过程，对维持细胞内外代谢平衡起着至关重要的作用，它可能是针刺对缺血缺氧性脑损伤具有保护作用的重要靶点。本研究探讨了针刺对局灶性脑缺血大鼠HIF-1α蛋白和mRNA表达的影响。

HIF-1α作为低氧信号转导途径中的关键因子，在生物体的氧供应、细胞代谢、心血管发育，以及一系列疾病的生理病理中起重要作用，发挥多水平的调节作用[6]。HIF-1α可调控多种低氧反应基因的转录，参与低氧反应信号转导过程，在缺血性脑血管疾病中发挥神经保护作用，主要通过调节下游靶基因及其产物的表达来发挥作用。有报道HIF-1α激活后可诱导数百个靶基因的表达，这些靶基因的蛋白产物涉及血管的生成和重塑、能量代谢、血管舒缩反应、细胞增殖和存活等多个方面[7,8]。目前，HIF-1α被认为是脑缺血后一系列反应的核心因素之一。近年来，HIF-1α在脑缺血中的神经保护作用被广泛报道[9-11]，采用药物诱导HIF-1α的表达对脑缺血损伤具有神经保护性作用，通过基因调控或药物干预的方法提高HIF-1的活性，可改善脑缺血症状[12]。本实验结果显示，针刺组HIF-1α蛋白和mRNA表达均明显增强，与假手术组、模型组比较差异有统计学意义，脑组织病理学结果显示针刺组大鼠脑组织坏死明显减少，针刺组大鼠神经体征具有明显的改善，这些结果表明针刺可以通过上调HIF-1α的表达，增加相关靶基因的表达，改善脑缺血区的微循环，发挥保护大脑缺血组织的作用。

微循环是影响缺血所致组织细胞损伤的关键环节[13]。针刺可显著增加脑缺血大鼠微循环血流量，改善其神经体征[1,2]，其机制可能为HIF-1α调控其下游靶基因如VEGF、内皮素-1(ET-1)等[14,15]，进而调节血管舒缩反应改善局部血液循环，促进缺血区侧支循环的形成，增加缺血区的血氧供应，从而保护神经元。HIF-1α对相关靶基因的调控规律及针刺干预后的效应是笔者下一步将要进行研究的课题。

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(2014-02-19收稿 2015-03-23修回)

(责任编辑 梁秋野)

Effects of acupuncture on hypoxia inducible factor -1α and local cerebral blood flow in rats with focal cerebral ischemia

ZHU Zaiqing1, XU Guigang1, GUO Yanli1, MA Bin1, LU Yan2.

1.Department of Neurology, Shandong Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces,Jinan 250014,China;2.Department of Experimental Acupuncturology,College of Acumox and Tuina,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

Objective To observe the effect of acupuncture on hypoxia inducible factor -1α and local cerebral blood flow in rats with focal cerebral ischemia.Methods Wistar rats were randomly divided into four groups:normal group, sham-operated group, model group and electroacupuncture(EA) group. Focal cerebral ischemia rat models were developed by middle cerebral artery occlusion(MCAO )with thread embolus. Electroacupuncture was applied to bilateral PC 6 and LI11 after MCAO. The expression of hypoxia inducible factor -1α was examined in MCAO rats by Western blot and real-time quantitative PCR (qPCR).Results Acupuncture could promote the recovery of neurological function in MCAO rats. Western blot and real-time qPCR showed that acupuncture promoted the hypoxia inducible factor -1α expression in the ischemic brain tissue with statistical significance(P<0.05).Conclusion Acupuncture promotes hypoxia inducible factor -1α expression in rats with focal cerebral ischemia. All the results suggest that the increased expression of hypoxia inducible factor -1α in the ischemic brain tissue plays an important role in brain protection.

electroacupuncture; focal cerebral ischemia;hypoxia inducible factor -1α

国家自然科学基金青年项目(81102652)，山东省自然科学基金(ZR2009CQ007)。

朱在卿，本科学历，副主任医师，E-mail:13969176990@139.com

1.250014 济南，武警山东总队医院神经内科；2.250355 济南，山东中医药大学针灸推拿学院

卢 岩，E-mail:luyanchinapenglai@126.com

R245.0