刘政波，毕研文，陈宝芳，仉劲，张亚玉※

(1．中国农业科学院特产研究所，长春 130112； 2．泰安市农业科学研究院中草药研究所，山东 泰安 271000)

泰山白首乌(CynanchumbungeiDecne)为萝雐科鹅绒藤属植物，又名“白首乌”，泰山山脉为其主产区，泰山白首乌位列“泰山四大名药”之首，是典型的药食两用植物，在民间具有悠久的药用历史，在泰沂山区，既是家喻户晓的滋补良药，也是珍贵的旅游商品之一，具有滋补肝肾、强壮筋骨、益精血、安心神之功效。泰山白首乌含有苯乙酮、戟叶牛皮消苷和挥发油等多种对人体有利的次生代谢产物[1～3]，具有抗肿瘤、提高免疫力等特殊的医疗和保健作用[4，5]。

由于受产地、气候和生态环境等因素的影响，不同产地泰山白首乌药材所含成分有一定的差异，仅针对中药材的某个有效成分进行定性、定量分析，并不能有效地控制中药材的质量[6]。目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中药与天然药物质量的有效手段，能从整体上控制质量[7，8]。本试验对泰山白首乌药材的指纹图谱进行了研究，以期对泰山白首乌药材的质量控制提供有效的方法。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪(600E四元梯度泵、2996光电二极管阵列检测器、中文Empowers色谱管理系统、四通道脱气机，美国Waters公司)；SZ-93自动双重蒸馏水器(上海亚荣化仪器厂)；FW177型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；KQ5200D数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇(分析纯，天津永大试剂厂)；水为二次蒸馏水。

11批泰山白首乌样品来源见表1，样品均经山东农业大学王建华教授鉴定为泰山白首乌。

表111批泰山白首乌样品来源

Table1

Eleven batches of C.bungei Decne.sample source

2 方法

2.1 供试品溶液制备

精确称量样品粉末0.2g(40目～60目)，用甲醇定容至25mL容量瓶中，超声提取30min，过0.22μm滤膜制得待测样品溶液。

2.2 HPLC色谱条件

色谱柱：Symmetry-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；测定温度：30℃；光电二极管阵列检测器；检测波长：200nm～400nm；进样量：20μL；梯度洗脱：甲醇(A)-水(B)，0min～40min，10%～40% A，40min～60min，40%～60% A。

2.3 数据处理方法

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版对所得HPLC图谱进行图谱匹配和相似度分析，选取峰面积大于1%的色谱峰进行标识，设置S4为参照图谱，经过多点校正，自动匹配，以中位数法，生成对照图谱R，由匹配数据的输出结果得到共有峰，建立泰山白首乌HPLC指纹图谱共有模式。

利用NTSYS-pc(2.1)对11个不同产地的7个供试样品的HPLC图谱共有峰匹配数据矩阵进行标准差标准化(STD)处理，再计算各个OUT之间欧氏距离(Euclidean distance)，采用类平均法(UPGMA)进行聚类。

3 结果与分析

3.1 泰山白首乌HPLC检测波长的确认

精密吸取泰山白首乌供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行操作，考察泰山白首乌供试品溶液在60min内三维色谱分离情况，见图1。从图1可以发现，在检测波长为265nm时，供试液有较多的色谱峰，并且各色谱峰能够较好地分离，最终确定指纹图谱的分析波长为265nm。

图1 泰山白首乌样品HPLC三维色谱图

3.2 共有指纹峰的标定

观察11个泰山白首乌样品甲醇提取物的检测结果，比较其液相色谱图，记录其共有峰，选择参照峰4号为S，测定其中7个共有峰相对峰面积和相对保留时间的比值，计算结果见表2和表3。

表2泰山白首乌指纹图谱的相对峰面积值

Table 2 Relative peak area of HPLC fingerprint chromatogram of C.bungei Decne

表3泰山白首乌指纹图谱的相对保留时间

Table 3 Relative retention time of HPLC fingerprint chromatogram of C.bungei Decne.

3.3 共有模式的建立和相似度计算

将11批药材HPLC指纹图谱的结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系2004版”，采用“中位数法”生成11批药材的对照图谱(图2)。再将11批药材的指纹图谱与生成的对照图谱相比较，得到各批药材的相似度(表4和图2)。从表4可以看出，与对照图谱R相比，11批泰山白首乌样品明显可以分为3类：第1类相似度为0.9～1.0，有较高的相似度，分别为S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10；第2类相似度为0.8～0.9，相似度一般，为S3；第3类相似度为0.7～0.8，相似度不高，为S11。不同产地泰山白首乌相似度的散点见图3，结果与表4一致。

3.4 评价模式的建立

选取不同产地的11批泰山白首乌作为建立指纹图谱的样品，并利用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版”进行相似度评价，分析结果为11批样品的相似度均大于0.7，确立共有峰7个(图4)。且11批药材共有指纹峰的相对保留时间的RSD值均小于0.1%，表明本试验所建立的方法符合指纹图谱技术的相关要求。但11批药材共有指纹相对峰面积RSD值最高达到9.685%，说明各类药材的化学成分及其相对含量还是有一定差别的，但差别并不是特别大。

图2 泰山白首乌不同产地指纹图谱及其共有模式

表411批泰山白首乌指纹图谱的相似度

Table 4 Similarity of HPLC Chromatography fingerprint of eleven batches of C.bungei Decne.

图3 不同产地的泰山白首乌相似度的散点图

Fig.3ScatterdiagramofthesimilarityofC.bungeiDecne.fromdifferentplaces

图4 不同产地泰山白首乌共有峰图谱

Fig.4CommonpeakchromatogramofC.bungeiDecne.fromdifferentplaces

4 结论

在HPLC色谱中，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版，对所得11批泰山白首乌样品HPLC图谱进行图谱匹配和相似度分析，建立了泰山白首乌HPLC指纹图谱共有模式。结果表明，11批泰山白首乌样品明显分为3类：第1类相似度为0.9～1.0，有较高的相似度，分别为S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10；第2类相似度为0.8～0.9，相似度一般，为S3；第3类相似度为0.7～0.8，相似度不高，为S11。同时，确定了11批泰山白首乌样品的7个共有峰，且共有指纹峰的相对保留时间的RSD值均小于0.1%，表明本试验所建立的方法符合指纹图谱技术的相关要求。但11批药材共有指纹相对峰面积RSD值最高达到9.685%，说明各类药材的化学成分及其相对含量还是有一定差别的，但差别并不是特别大。

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