邹 慧，李丹丹，陈 静，劳雪芬，曹 铮，尚秋辰，许小琴*

(1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009)

富硒女贞子对热应激乳腺上皮细胞增殖、凋亡及抗氧化功能的影响

邹 慧1，2，李丹丹1，2，陈 静1，2，劳雪芬1，2，曹 铮1，2，尚秋辰1，2，许小琴1，2*

(1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009)

为阐明富硒女贞子及其主要成分对高温体外培养乳腺上皮细胞增殖、凋亡及抗氧化功能的影响，以42 ℃作为热应激温度，37 ℃作为对照温度，于42 ℃培养的乳腺上皮细胞分别添加不同质量浓度的富硒女贞子水煎液、齐墩果酸、蛋白质，采用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性。结果表明，各质量浓度的富硒女贞子水煎液、齐墩果酸及蛋白质均能显著提高热应激状态下乳腺上皮细胞的增殖活性(P<0.05)、显著降低细胞的凋亡率(P<0.05)、显著提高细胞培养上清中SOD的活性(P<0.05)，且富硒女贞子组明显优于普通女贞子组。结果提示，富硒女贞子水煎液、齐墩果酸及蛋白质对热应激引起的乳腺细胞增殖活性降低及细胞凋亡有明显的改善作用，并能提高热应激状态下乳腺细胞的抗氧化功能。

热应激；硒；女贞子；凋亡；乳腺上皮细胞

热应激是指机体应对环境高温所产生的非特异性应答反应[1]，近年来对热应激的研究已达到细胞水平。不少研究发现[2-3]，高温会导致乳腺上皮细胞增殖活性降低且诱导其凋亡。补中益气类中草药大多具有抗氧化、缓解机体热应激的功效，马得莹等将女贞子作为饲料添加剂有效改善了热应激下蛋鸡的生产性能及抗氧化功能，减轻热应激对蛋鸡的危害[4]。但目前将中草药用于细胞热应激方面的报道很少，本试验通过对体外培养乳腺上皮细胞进行高温处理，并添加富硒女贞子及其主要成分，从细胞的生长和凋亡方面来探索富硒女贞子对乳腺细胞热应激的干预作用，为阐明富硒女贞子抗热应激的分子机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要细胞与试剂

MCF-7人乳腺上皮细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；富硒女贞子(硒含量1.88 μg·g-1)、对照药女贞子由本实验室保存提供[5-6]；改良型RPMI-1640培养基(HyClone)；胎牛血清(银香国际)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio)；四唑蓝(MTT，Sigma公司)，临用前配成5 mg·mL-1，漩涡混合仪混匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃避光保存；二甲基亚砜(DMSO，天津市科密欧化学试剂有限公司)；FITC Annexin V 凋亡试剂盒(BD公司)。

1.2 主要仪器

核酸蛋白浓度检测仪(美国伯腾仪器有限公司)；CO2培养箱(美国Revco公司)；倒置显微镜(重庆光学仪器厂产品)；超净工作台(苏州净化设备厂，SWcg1F)；MP200A分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；XW-80微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；FACS Aria 流式细胞仪。

1.3 试验方法

1.3.1 药物制备 精确称取女贞子粉末，提取富硒女贞子蛋白质[7]、齐墩果酸[8]，临用前配制好工作浓度，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。富硒女贞子水煎液中硒含量为1.77 μg·g-1(普通女贞子水煎液硒含量为0.225 μg·g-1)，富硒女贞子齐墩果酸中含硒量为4.9 ng·g-1(普通女贞子中齐墩果酸的含硒量为0.3 ng·g-1)，富硒女贞子中蛋白质的含硒量为0.681 μg·g-1(普通女贞子中蛋白质的含硒量为0.014 μg·g-1)[9]。

1.3.2 乳腺上皮细胞活率测定 将乳腺上皮细胞以1.5 ×105·mL-1的量接种于96孔板中，每孔100 μL，37 ℃ 培养12 h，观察每孔细胞贴壁80%～90%后分组试验。设3大组：37 ℃对照组、42 ℃热应激组、42 ℃给药组，每组4个重复，其中给药组分为富硒女贞子水煎液、蛋白质、齐墩果酸组以及普通女贞子水煎液、蛋白质、齐墩果酸组。给药组换成含不同药物的维持液(胎牛血清浓度为2%)，37 ℃对照组和热应激组换成维持液，对照组37 ℃培养，热应激组和给药组置于42 ℃培养1、3、6、8 h后采用MTT法检测各时间段内细胞的存活率。

1.3.3 SOD活性的测定 将乳腺上皮细胞以1×105·mL-1的量接种于6孔板中，每孔1 mL，37 ℃ 培养24 h，观察每孔细胞贴壁80%～90%分组试验，设3大组：37 ℃对照组、42 ℃热应激组、42 ℃给药组(同上)，每组6个重复。给药组换成含不同药物的维持液，37 ℃对照组和热应激组换成维持液，对照组37 ℃培养，热应激组和给药组置于42 ℃培养3 h后放回37 ℃继续培养12 h，然后收集细胞培养液上清，采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)按照试剂盒说明书测定SOD活性。

1.3.4 细胞凋亡率的测定 将乳腺上皮细胞以4×105·孔-1的量接种于6孔板中，每孔1 mL，37 ℃ 培养12 h，观察每孔细胞贴壁80%～90%分组试验，设3大组：37 ℃对照组、42 ℃热应激对照组、42 ℃给药组(同上)，每组6个重复。培养给药组换成含不同药物的维持液，对照组和热应激对照组换成维持液，对照组37 ℃培养，热应激组和给药组置于42 ℃培养3 h后采用Annexin V-FICT/PI试剂盒及流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4 数据分析

2 结 果

2.1 富硒女贞子对热应激乳腺上皮细胞增殖活性的影响

采用改良的MTT法检测细胞增殖活性，结果表明：42 ℃的热应激组细胞在培养1、3、6、8h后增殖活性均显著低于37 ℃培养的常温对照组(P<0.05)；与42 ℃热应激组相比，各浓度的富硒女贞子水煎液组(图1)、齐墩果酸组(图2)、蛋白质组(图3)均能显著提高细胞的增殖活性(P<0.05)，且富硒组明显优于普通女贞子组，其中富硒女贞子水煎液的作用效果为极显著(P<0.01，图中未标注)，当质量浓度达到8mg·mL-1时作用效果最佳，在热应激1、3、6、8h后较热应激组细胞增值率提高分别达80.9%、35%、40%、34.7%。

不同字母代表有显著差异(P<0.05)，下同The data with different superscript letters in column differ significantly (P<0.05)，the same as below图1 富硒女贞子水煎液对热应激乳腺细胞增殖活性的影响Fig.1 The effect of water exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

图2 富硒女贞子齐墩果酸对热应激乳腺细胞增殖活性的影响Fig.2 The effect of oleanolic acid exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

2.2 富硒女贞子对热应激乳腺上皮细胞SOD活性的影响

本试验采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，结果如表1所示：各质量浓度水平的富硒女贞子水煎液、齐墩果酸、蛋白质均显著提高42 ℃热应激下乳腺上皮细胞SOD的活性(P<0.05)，且水煎液、齐墩果酸、蛋白质浓度分别达到8 mg·mL-1、10 μg·mL-1及800 μg·mL-1时作用效果最佳，与热应激组差异极显著(P<0.01)。此外，8、10 mg·mL-1的富硒女贞子水煎液提高SOD活性的作用效果极显著优于普通女贞子(P<0.01)，各浓度富硒女贞子蛋白质和齐墩果酸提高SOD活性的作用效果优于普通女贞子，但差异不显著(P>0.05)。

图3 富硒女贞子蛋白质对热应激乳腺细胞增殖活性的影响Fig.3 The effect of protein exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

表1 富硒女贞子对热应激乳腺上皮细胞SOD活性的影响

Table 1 The effect of se-LLF on antioxidant activity of mammary epithelial cells after heat treatment

U·mL-1

同列肩注小写字母表示不同组别与对照组的比较；同列肩注大写字母表示富硒女贞子与女贞子的比较。同列肩注相同字母差异不显著(P>0.05)，同列肩注相邻字母差异显著(P<0.05)，同列肩注相间字母差异极显著(P<0.01)；其中水煎液低、中、高剂量分别为5、8、10 mg·mL-1，齐墩果酸为5、10、20 μg·mL-1，蛋白质为400、800、1 000 μg·mL-1(下同)

The same column shows a comparison of the shoulder note uppercase different groups and the control group；note the shoulder with lowercase letters column comparison with SeLigustrumlucidum's.Note the shoulder with the same letter column is no significant difference (P> 0.05)，note adjacent letters column shoulder with significant differences (P<0.05)，note the shoulder with white letters out significant difference (P<0.01).The low，medium and high concentration of water extract of se-LLF are 5，8 and 10 mg·mL-1.The low，medium and high concentration of oleanolic extract of se-LLF are 5，10 and 20 μg·mL-1.The low，medium and high concentration of protein extract of se-LLF are 400，800 and 1 000 μg·mL-1(The same as below)

2.3 富硒女贞子对热应激乳腺上皮细胞凋亡的影响

本试验采用细胞流式术检测细胞凋亡，结果如表2所示，37 ℃培养时，细胞状态良好，凋亡细胞仅为细胞总数的2.8%，42 ℃热应激3 h细胞凋亡率极显著上升达到14%(P<0.01)。与42 ℃热应激组相比，各质量浓度水平的富硒女贞子水煎液、齐墩果酸、蛋白质均能极显著降低细胞凋亡率(P<0.01)，其中8 mg·mL-1的富硒女贞子水煎液、10 μg·mL-1的齐墩果酸以及800 μg·mL-1的蛋白质作用效果最佳，降低细胞凋亡比例分别达到74%、66%及68%。此外，8 mg·mL-1的富硒女贞子水煎液、5 μg·mL-1的齐墩果酸以及400 μg·mL-1的蛋白质降低细胞凋亡率的作用效果显著优于普通女贞子(P<0.05)，其他质量浓度的富硒女贞子水煎液、齐墩果酸和蛋白质降低细胞凋亡率的的作用效果亦优于普通女贞子，但差异不显著(P>0.05)。具体凋亡图谱见图4a～t。

(图4，转下页)

(Fig.4，continued on the next page)

(接上页)

(Continued)

a.37 ℃对照组；b.42 ℃热应激组；c～e.富硒女贞子水煎液组，分别为5、8、10 mg·mL-1；f～h.普通女贞子水煎液组，浓度同富硒女贞子水煎液组；i～k.富硒女贞子齐墩果酸组，分别为5、10、20 μg·mL-1；l～n.普通女贞子齐墩果酸组，质量浓度同富硒女贞子齐墩果酸组；o～q.富硒女贞子蛋白质组，分别为400、800、1 000 μg·mL-1；r～t.普通女贞子蛋白质组，质量浓度同富硒女贞子蛋白质组a.37 ℃ contrast group；b.42 ℃ heat stress group；c-e.Water extract of se-LLF groups (5，8，10 mg·mL-1)；f-h.Water extract of LLF groups (5，8，10 mg·mL-1)；i-k.Oleanolic extract of se-LLF groups (5，10，20 μg·mL-1)；l-n.Oleanolic extract of LLF groups(5，10，20 μg·mL-1)；o-q.Protein exact of se-LLF groups (400，800，1 000 μg·mL-1)；r-t.Protein exact of LLF groups (400，800，1 000 μg·mL-1)图4 流式细胞仪检测各组乳腺上皮细胞的凋亡图谱Fig.4 Apoptosis chart of cultured mammary epithelial cells detected of different group by flow cytometry

表2 富硒女贞子对热应激乳腺上皮细胞凋亡的影响

Table 2 The effect of se-LLF on apoptosis of mammary epithelial cells after heat treatment %

水煎液WaterexactofLLF齐墩果酸Oleanolicacid蛋白质Protein富硒Se-enriched普通Ordinary富硒Se-enriched普通Ordinary富硒Se-enriched普通Ordinary低5.50±0.23cA6.10±0.38cdA7.80±0.44dA11.60±0.32dB6.80±0.1dA10.70±0.55dB中3.70±0.18bA5.20±0.52cB4.70±0.67bA5.30±0.19cA4.50±0.72cA5.70±0.89cA42℃高5.10±0.21cA5.40±0.29cA5.70±0.28cA6.30±0.84cA6.30±0.13dA7.00±0.47cA对照14.00±0.33f37℃2.80±0.15a

3 讨 论

3.1 富硒女贞子能提高热应激乳腺上皮细胞SOD活性

在正常情况下，机体内活性氧(ROS)自由基的产生、利用、清除保持着动态的平衡。当机体处于热应激状态时，体内ROS的量会相对升高，超过机体的清除能力，引起细胞DNA氧化损伤。SOD广泛存在于生物体内，能维持机体中自由基产生和清除动态平衡，是一种重要的抗氧化酶，因此SOD活性能间接地反映机体清除氧自由基的能力。有报道称，女贞子水提物可提高肉仔鸡血清和组织中SOD活性[13]，从而提高肉鸡的抗氧化功能。硒作为体内抗氧化酶系的组分，以直接清除自由基和影响非酶类抗氧化剂的代谢等方式在体内发挥重要的抗氧化作用，硒的抗氧化功能是其他生理功能的基础[14]，研究表明[15-16]，在饲料中添加一定量的硒可以有效地改善热应激状态下动物的抗氧化性能，并能提高机体的抵抗力。本研究佐证上述研究结果，富硒和普通女贞子及其主要成分均能提高热应激乳腺上皮细胞的抗氧化功能，女贞树通过花果叶面喷施硒肥而收获的富硒女贞子药材中硒含量显著提高，硒和女贞子协同作用，使得富硒女贞子的效果明显优于普通女贞子。

3.2 富硒女贞子能提高热应激乳腺上皮细胞增殖活性

本研究中，42 ℃热应激组乳腺上皮细胞增殖活性始终显著低于37 ℃对照组，这表明高温对乳腺上皮细胞的生长造成严重的损伤，这与多人的研究结果一致[9-10]。研究发现在热应激条件下，细胞功能产生许多的异常，包括对蛋白质合成的抑制、蛋白质结构和功能的缺失、新陈代谢的改变、细胞膜结构的改变，从而减少了细胞的增殖[11-12]。在添加富硒女贞子水煎液及其主要成分后，有效缓解了高温对乳腺上皮细胞增殖活性的抑制，其中富硒女贞子水煎液及齐墩果酸促进热应激乳腺细胞增殖效果甚至明显高于37 ℃常温对照组。这表明富硒女贞子能显著提高热应激对乳腺上皮细胞增殖活性的影响，使其恢复到正常水平，并以8 mg·mL-1的富硒女贞子水煎液的效果最佳，这种作用与提高细胞SOD活性的趋势一致。推测，富硒女贞子促进细胞在热应激状态下的增殖活性可能与其提高细胞SOD活性有关，其作用机制还需进一步研究。

3.3 富硒女贞子能降低热应激乳腺上皮细胞凋亡率

高温诱导体外培养细胞凋亡已被许多学者证实，高温会导致细胞线粒体损伤，释放促凋亡因子，诱导细胞发生凋亡[17-18]。本研究采用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果表明高温显著促进细胞凋亡，添加富硒女贞子水煎液及其主要成分后，有效降低细胞凋亡率。有报道称，细胞内活性氧(ROS)水平的轻微增高促进细胞的增殖和分化，而胞内ROS水平的显著增高则快速触发细胞的凋亡[19]，而SOD活性以及抗ROS活力与细胞凋亡率呈负相关[20]。由此推断，富硒女贞子可能是通过提高细胞SOD活性，改善细胞在热应激状态下的抗氧化功能从而降低细胞的凋亡率。

综上所述，富硒女贞子水煎液、齐墩果酸及蛋白质均能提高热应激状态下乳腺细胞的抗氧化功能，对热应激引起的乳腺细胞增殖活性降低及细胞凋亡有明显的改善作用。

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(编辑 白永平)

Influence of Se-enrichedLigustrumlucidiumFruit on Proliferation，Apoptosis and Antioxidant Activity of Mammary Epithelial Cells under Heat Stress

ZOU Hui1，2，LI Dan-dan1，2，CHEN Jing1，2，LAO Xue-fen1，2，CAO Zheng1，2，SHANG Qiu-chen1，2，XU Xiao-qin1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China)

The experiment was conducted to study the effects of se-enrichedLigustrumlucidiumFruit on proliferation，apoptosis and antioxidant activity of mammary epithelial cells cultured under heat circumstanceinvitro.The heat stress model temperature was set as 42 °C and the temperature 37 °C was set as the control.In the experiment，heat-stressed mammary epithelial cells were cultured with different concentration of water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF.The growth and apoptosis rate of cultured mammary epithelial cells were detected by MTT and flow cytometry，respectively，and the content of SOD in the supernatant fluid of cultured mammary epithelial cells was detected by xanthine oxidase.The results showed that the proliferation of mammary epithelial cells cultured under high temperature was significantly promoted in each experimental concentration of water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF (P<0.05).The apoptosis rate decreased significantly (P<0.05)，the activity of SOD (P<0.05) was increased significantly，and the results were better than those of the ordinaryLigustrumlucidumgroup.In conclusion，water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF can not only improve the proliferation and apoptosis rate of heat-stressed mammary epithelial cells，but also improve their antioxidant capacity.

heat stress；selenium；FructusLigustriLucidi；apoptosis；mammary epithelial cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.022

2014-09-19

国家自然科学基金(31172354)；江苏高校优势学科建设工程资助项目；江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心资助项目

邹 慧(1989-)，女，江苏苏州人，硕士生，主要从事中草药药理作用与兽医临床应用的研究，E-mail：zouhui1314@126.com

*通信作者：许小琴，教授，主要从事中兽医医药科学研究，E-mail：xuxq@yzu.edu.cn

S853.74

A

0366-6964(2015)06-1047-08