西电集团医院 (西安710077)

李 欣 汪建军△ 任超杰 扈会整 王 欣

主动外排机制和膜蛋白缺失在粘质沙雷菌耐药中的研究*

西电集团医院 (西安710077)

李 欣 汪建军△任超杰 扈会整 王 欣

目的： 研究粘质沙雷菌的耐药性与细胞的主动外排机制及细菌膜蛋白缺失相关性。方法： 收集对亚胺培南和美罗培南耐药的粘质沙雷菌株15株，应用PCR扩增和DNA序列分析，采用E试验观察氰氯苯腙对亚胺培南最低抑菌浓度(MIC)的影响，以研究细胞内是否存在主动外排机制和膜蛋白缺失现象。 结果： 当CCCP存在时，其中7株粘质沙雷菌亚胺培南，美罗培南的 MIC 值下降，提示存在主动外排机制。其中有1株OprD2蛋白缺失，1株外排泵MexB基因阳性。 结论： 耐碳青霉烯类药物的粘质沙雷菌的耐药性与细胞的主动外排机制和膜蛋白缺失有关。

粘质沙雷菌(Serratia marcescens)是革兰阴性小杆菌，单个或短链存在，常存在于人体泌尿道和呼吸道，在儿童胃肠道贮菌也比较常见。当机体免疫力下降时，常能引起败血症、肺炎、脑膜炎等各种感染性疾病，且对多种抗生素表现耐药。近年来出现了耐亚胺培南和美罗培南粘质沙雷菌菌株。粘质沙雷菌是引起院内感染的重要条件致病菌之一，并出现散播情况，给临床治疗和院内感染控制带来了极大的挑战[1]。粘质沙雷菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制[2]，是否与细胞内存在主动外排机制有关，我们对此作了相应的试验和基因分型。

材料与方法

1 材 料

1.1 菌株来源与质控菌株：收集2010～2014年从咸阳地区初次培养亚胺培南(IMP)和美罗培南(MPM)耐药的粘质沙雷菌15株，大肠埃希菌ATCC25922为实验的质控菌株。

1.2 设备和试剂：Eppendorf centrifuge5417R低温离心机；MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)；Bio-Rad电泳仪及成像系统；琼脂糖购自Oxoid公司；100 bp DNA梯带标志物购自大连宝生物公司；氰氯苯腙(CCCP)终浓度5 mg/L购自Sigma公司；IMP E test试条购自瑞典AB Biodisk公司；M-H培养基购自杭州天和生物公司；菌种及药敏鉴定使用VITEK-2全自动细菌药敏鉴定系统及配套试剂(法国梅里埃公司)；PCR扩增试剂购于上海生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 CCCP(羰基氰氯苯腙)抑制作用：在血琼脂平板上接种细菌，35℃培养24h后，挑取2～3个菌落，用生理盐水充分混匀，并调节浊度为0.5个麦氏单位，按K-B法涂满整个含有CCCP(浓度为5mg/L)的M-H琼脂平板和一般M-H琼脂平板，并贴上E-test试纸条，35℃培养箱培养24h，观察CCCP对IMP的MIC的逆转作用。当存在CCCP时IMP的MIC比不含有CCCP时IMP的MIC下降1/3，提示存在主动外排机制，否则提示不存在主动外排机制。

2.2 基因检测方法：oprD2基因热循环参数为93℃预变性2min→93℃60s→55℃40s→72℃90s，最后一个72℃延伸5 min，共循环35周期。其余基因热循环参数为：93℃预变性2min→93℃60s→55℃40s→72℃90s，最后一个72℃延伸5min，共循环35周期；纯水作为阴性对照。耐药基因检测试剂盒购自上海生物工程公司。应用PCR方法检测，引物序列见附表。

附表 基因引物序列

结 果

1 基因检测结果 15株耐碳青霉烯酶的粘质沙雷菌经上述几种基因进行扩增并检测，结果有1株OprD2蛋白缺失，1株外排泵MexB基因阳性，其他未扩增出，扩增结果见附图。

附图 基因扩增结果(1.OprD2,2. MexB,3.阴性对照,

4.M为100bp DNA梯带)

2 CCCP存在与否对IMP体外抗茵活性的影响 15株IMP和MPM耐药的粘质沙雷菌株中，有6株外排泵表型试验阳性，CCCP存在使IMP的MIC下降至4个浓度梯度的菌株有4株，下降至3个浓度梯度的菌株有1株，CCCP存在使MPM的MIC下降至4个浓度梯度的菌株有3株，其中有2株菌同时对两种药物有明显外排作用，其余菌株在CCCP存在与否IMP(MPM)的MIC值无变化。

讨 论

粘质沙雷菌广泛存在与自然界，为条件致病菌，是引起肠道感染的主要病原菌，与许多医院的院内感染暴发流行有关，能够引起多种疾病，如：呼吸道疾病、尿路感染等。近几年，由于抗生素的不合理使用，粘质沙雷菌对抗生素的耐药呈蔓延趋势，且耐药基因复杂多样，耐药程度也日趋严重，耐药菌的治疗成为一个严重的问题。本研究主要对15株IMP和MPM耐药的粘质沙雷菌的膜蛋白缺失和主动外排进行检测，并探讨其耐药机制。

外膜孔蛋白OprD分为1型和2型，研究表明：与IMP耐药有关的为外膜孔蛋白OprD2，IMP由于分子小，通过外膜蛋白孔道可选择性快速进入菌体，与菌体的特异性位点进行结合，起到抗菌作用。当外膜通透性下降，外膜蛋白的改变、减少或缺失 ，使抗菌药物不能进入菌体，从而产生耐药。本研究发现：15株耐碳青霉烯酶类药物粘质沙雷菌中，OprD2基因缺失1株。结果表明：OprD2基因缺失不是本组耐药的主要原因，但不排除因OprD2基因突变或基因表达下调，从而导致粘质沙雷菌对IMP耐药。

粘质沙雷菌细胞膜上的主动外排蛋白包括外膜通道蛋白、内膜蛋白和膜连接蛋白，主动外排蛋白是导致粘质沙雷菌对多种抗菌药物表现为多重耐药的主要原因。粘质沙雷菌细胞膜上的这些主动外排蛋白组成了主动外排系统，主要有AcrAB[4]、SdeXY[5-6]、SmdAB[7-8]、SmfY[9]及SdeCDE[8-10]系统。我们研究了粘质沙雷菌的外排泵基因MexR、MexB、acrB、acrA，其中MexB基因阳性一株。CCCP为质子泵抑制剂，能破坏细菌跨胞浆膜的质子梯度，导致转运蛋白失去能量供应而起作用。一般认为CCCP作用使粘质沙雷菌对IMP的MIC下降至1/3，表明细菌可能存在泵出机制，我们研究有6株外排泵表型试验阳性，说明细菌存在主动外排系统 ，此系统可以将已进入细菌胞质的抗菌药物排出菌体外，使临床上治疗失败。粘质沙雷菌对常用抗菌药物及对碳青霉烯类药物耐药的机制复杂，膜孔蛋白OprD2基因缺失以及外排泵出机制存在是其重要的耐药机理。

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(收稿：2015-06-04)

Study on the active efflux mechanism and the absence of membrane proteins in Serratia marcescens resistence

Xidian Group Hospital (Xi’an710077)

Li Xin Wang Jianjun Ren Chaojie et al

Objective：Study the drug resistance of Serratia marcescens whether related to the cells active efflux mechanism and the absence of bacterial membrane proteins or not. Methods：collected 15 strains Serratia marcescens that resist Imipenem and Meropenem ,application PCR amplification and DNA sequence analysis. adopt E test experiment observe the influence of CCCP for Imipenem minimal inhibitory concentration. in order to study intracellular was exist active efflux mechanism and the absence of membrane proteins or not. Results：When CCCP exist, there were 7 strains serratia marcescens for imipenem and Meropenem’MIC value decreased, prompting exist active efflux mechanism bacterial, and 1 strain absent OprD2protein, 1 strain efflux pump MexB gene positive. Conclusion：The resistance of Serratia marcescens that resist Carbapenemase related to the cells active efflux mechanism and the absence of bacterial membrane proteins .

Serratia marcescens Imipenem @MexB gene @OprD2protein Drug resistance,bacterial

*陕西省科学技术研究发展计划项目(2014K11-02-03-09)

粘质沙雷菌 亚胺培南 @MexB基因 @OprD2蛋白 抗药性，细菌

R446.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.029

△陕西省核工业215医院