胡北侠，许传田，杨少华，黄艳艳，张 琳，黄庆华，霍亚飞，张 伟，张秀美*

(1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100；2.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)

山东地区鸡传染性支气管炎病毒抗原相关性和血清分型

胡北侠1，许传田1，杨少华1，黄艳艳1，张 琳1，黄庆华1，霍亚飞2，张 伟1，张秀美1*

(1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100；2.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)

为进一步明确山东地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行病学，对IBV分离株之间以及与疫苗株之间的抗原相关性进行了分析。分别制备了3个疫苗株(4/91、H120和Ma5)和18个分离株的单因子阳性血清，通过鸡胚交叉中和试验测定了阳性血清对同源病毒和异源病毒的中和效价，计算了不同毒株之间的抗原相关系数(R值)，并根据R值进行血清分型。结果显示，3个疫苗株和18个分离株可分为5个血清型。疫苗株4/91属于血清Ⅰ型，H120、Ma5与2个分离株(SDWF0608和SDLY0701)属于同一血清型，分离株SDZB0808与SDLY0702、CK/CH/SD08/007和CK/CH/SD09/001等15个毒株为同一血清型，CK/CH/SD09/006和CK/CH/SD10/001分别与其他3和6个分离株组成两个血清型。进一步分析发现，部分IBV毒株之间表现单向中和反应性，属于同一血清型的IBV毒株之间抗原相关性可能存在明显差异。本研究结果一方面表明IBV毒株之间复杂的抗原相关性，另一方面显示IBV流行株与3个疫苗株之间抗原性存在明显差异。

鸡传染性支气管炎病毒；交叉中和试验；抗原相关性；血清型

鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是严重危害世界养禽业的一种高度接触性传染病，病原是禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)。IBV为单股正链RNA病毒，很容易通过基因突变、插入、缺失和重组等分子机制产生新的变异株[1-3]。根据本实验室前期研究结果，山东地区近年来IBV流行株的基因型为QX，同时存在Mass和TC07-2基因型毒株[4-5]。疫苗免疫是预防IBV感染的主要技术措施之一。目前，包括H120在内的多个疫苗株在山东地区广泛应用，但免疫鸡群仍然不断发生IBV的感染，提示IBV疫苗株与流行株之间可能存在明显的抗原性差异。因此，本研究通过交叉中和试验对IBV流行株的抗原性进行分析，以明确IBV流行株之间以及流行株与疫苗株之间的抗原相关性，以进一步丰富IBV的流行病学信息并为此病的有效防控提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病毒

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗株H120购自中国兽医药品监察所，4/91和Ma5购自英特威公司(Nobillis)，由本实验室鉴定保存。18个IBV流行株均是从山东地区发病鸡群分离鉴定，相关背景资料见表1和本实验室相关研究报道[4-5]。

1.2 SPF鸡胚和SPF鸡

SPF鸡和9～11日龄SPF鸡胚均购自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心。

1.3 IBV单因子阳性血清的制备

选择3个IBV常用疫苗株(H120、Ma5和4/91)和18个分离株，参考文献[6]方法，制备免疫用IBV灭活抗原，分别免疫4～5周龄的SPF鸡，在负压隔离器内饲养，制备各个IBV毒株的单因子阳性血清。

1.4 鸡胚交叉血清中和试验

根据文献[6]、文献[7]方法，测定3个IBV疫苗株和18个分离株的病毒滴度(EID50)，采用固定病毒稀释血清的方法(β-微量法)进行鸡胚交叉中和试验。阳性血清进行2倍倍比稀释，每个稀释度血清分别与等体积200 EID50的病毒液混匀，室温作用60 min后接种9～11日龄SPF鸡胚，0.2 mL·胚-1，每稀释度接种5枚，置37 ℃培养至18日龄，弃去24 h内死亡鸡胚，根据鸡胚死亡及病变进行结果判定，以能使50%以上鸡胚得到保护的血清最高稀释倍数为血清的中和效价。首先测定阳性血清对同源病毒的中和效价，然后分别测定阳性血清对其他IBV毒株的中和效价。

1.5 IBV抗原相关系数的计算和血清分型

2 结 果

2.1 IBV病毒滴度(EID50)测定

3个IBV疫苗株H120、Ma5和4/91以及18个IBV分离株病毒滴度测定结果见表1。

2.2 鸡胚交叉血清中和试验

3个IBV疫苗株和18个分离株单因子阳性血清对同源病毒的中和效价以及它们之间交叉中和试验结果见表2。总体而言，大多数IBV阳性血清对同源病毒的中和效价比对异源病毒的中和效价高。在3个IBV疫苗株之间，4/91不能被H120和Ma5血清中和，H120和Ma5也不能被4/91血清中和，H120和Ma5之间能够交叉中和。

在18个IBV分离株与3个疫苗株之间，8/18、9/18和11/18的分离株可以分别被4/91、H120和Ma5阳性血清中和。其中3个分离株(CK/CH/SD09/005、CK/CH/SD08/007和SDIB702/2012)可以同时被4/91、H120和Ma5血清不同程度地中和，3个分离株(CK/CH/SD09/006、CK/CH/SD10/003和SDWF0711)可以被4/91和Ma5血清中和，4个分离株(SDWF0608、SDSG0801、SDIB669/2012和SDZB0808)可以被H120和Ma5血清中和。CK/CH/SD10/001和CK/CH/SD10/002仅被4/91血清中和，SDTA06111和SDLY0701仅被H120血清中和，SDLY0702仅被Ma5血清中和。而3个分离株(CK/CH/SD08/006、CK/CH/SD09/001和CK/CH/SD09/003)与这3个疫苗株血清反应均为阴性。

表1 18个IBV分离株和3个疫苗株分离时间、基因型和病毒滴度

Table 1 Year，genotppe and viral titre of eighteen IBV isolates and three vaccine strains

毒株Strain分离时间Year基因型Genotype病毒滴度/(EID50·0.2mL-1)Virustiter(EID50·0.2mL-1)4/91-4/9110-5.5H120-Mass10-5.5Ma5-Mass10-5.2SDTA061112006Mass10-6.1SDWF06082006QX10-5.0SDLY07012007QX10-5.6SDLY07022007QX10-6.2SDWF07112007QX10-5.3SDSG08012008QX10-5.4SDZB08082008QX10-6.0CK/CH/SD08/0062008QX10-5.8CK/CH/SD08/0072008QX10-5.5CK/CH/SD09/0012009QX10-6.0CK/CH/SD09/0022009QX10-5.2CK/CH/SD09/0052009TC07-210-6.2CK/CH/SD09/0062009QX10-6.2CK/CH/SD10/0012010QX10-6.0CK/CH/SD10/0022010QX10-5.3CK/CH/SD10/0032010QX10-5.5SDIB669/20122012QX10-5.3SDIB702/20122012QX10-5.3

-.IBV疫苗株 -.IBV vaccine strain

在18个IBV分离株中， 5个分离株(SDZB0808、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/002和CK/CH/SD10/003)的阳性血清可以中和3个疫苗株和所有分离株，且对大部分异源病毒的中和效价与对同源病毒的中和效价相同。

此外，交叉中和试验结果显示，无论疫苗株与分离株还是各分离株之间，两个IBV毒株之间经常表现单向交叉中和反应。如4/91与SDZB0808之间，SDZB0808与4/91阳性血清反应阴性，但是4/91可以被SDZB0808血清中和。再如分离株CK/CH/SD09/005阳性血清不能中和SDWF0608、CK/CH/SD08/006、CK/CH/SD08/007和SD/CH/SD09/001，但CK/CH/SD09/005可以被这4个毒株的阳性血清中和。

2.3 IBV抗原相关系数与血清型分析

表4 18个IBV分离株和3个疫苗株血清分型

Table 4 Serotype of eightteen IBV isolates and three vaccine strains

血清型Serotype参考株Referencestrain抗原相关系数Antigenicrelatednessvalues同一血清型的毒株IBVstrainsinthesameserotypeⅠ4/91R≥80%4/91ⅡH120R≥80%H12025%≤R<80%SDWF0608(Ⅱ,Ⅲ),SDLY0701(Ⅱ,Ⅲ),Ma5ⅢSDZB0808R≥80%SDLY0701(Ⅱ,Ⅲ),SDLY0702,CK/CH/SD08/007,CK/CH/SD09/001(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD09/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD10/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),SDIB669/2012,SDIB702/2012(Ⅲ,Ⅴ)25%≤R<80%SDTA06111(Ⅲ,Ⅴ),CK/CH/SD09/005,SDWF0608(Ⅱ,Ⅲ),SDSG0801,CK/CH/SD10/002,CK/CH/SD08/006,SD-WF0711(Ⅲ,Ⅴ)ⅣCK/CH/SD09/00625%≤R<80%CK/CH/SD09/001(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD09/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD10/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ)ⅤCK/CH/SD10/00125%≤R<80%SDTA06111(Ⅲ,Ⅴ),SDWF0711(Ⅲ,Ⅴ),CK/CH/SD09/001(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD09/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),CK/CH/SD10/003(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),SDIB702/2012(Ⅲ,Ⅴ)

SDZB0808与SDTA06111、CK/CH/SD09/005和SDWF0608等15个分离株之间抗原相关系数为25%～100%，属于同一血清型(Ⅲ型)。其中8个IBV分离株(SDLY0701、SDLY0702、CK/CH/SD08/007、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/003、SDIB669/2012和SDIB702/2012)与SDZB0808抗原相关系数为100%； SDZB0808与另外7个分离株(SDTA06111、SDWF0608、CK/CH/SD09/005、SDSG0801、CK/CH/SD10/002、CK/CH/SD08/006和SDWF0711)抗原相关系数为25%～50%，属于同一血清型的不同亚型。

此外，CK/CH/SD09/006和CK/CH/SD10/001两个毒株之间相关系数为3%，属于不同血清型。它们与SDZB0808抗原相关系数分别为13%和18%，与SDZB0808血清也不同。CK/CH/SD09/006与CK/CH/SD09/001和 CK/CH/SD09/003两个毒株相关系数均为35%，与CK/CH/SD10/003相关系数为25%，属于同一血清型(Ⅳ型)的不同亚型。CK/CH/SD10/001与SDWF0711、SDTA06111、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/003和SDIB702/2012相关系数为25%～70%，属于同一血清型(Ⅴ型)的不同亚型。不过需要指出的是，CK/CH/SD09/006、CK/CH/SD10/001与SDZB0808的抗原相关性分别为13%和18%，SDZB0808阳性血清对CK/CH/SD09/006、CK/CH/SD10/001两个毒株的中和效价均与同源效价相同，如果按照J.B.Brooksby血清型划分标准(R<10%为不同血清型)或IBV单向交叉中和试验结果进行血清分型[6-7，11]，这两个毒株也可以与SDZB0808划入同一血清型。

值得注意的是，同一个IBV可能同时属于多个血清型，如SDWF0608、SDLY0701同时属于以H120和SDZB0808为参考株的Ⅱ型和Ⅲ型，此外还有SDTA06111(Ⅲ，Ⅴ)、SDWF0711(Ⅲ，Ⅴ)和SDIB702/2012(Ⅲ，Ⅴ)等。另一方面，属于同一血清型的IBV之间抗原相关系数也可能差别较大，如与SDZB0808抗原相关系数均为100%的8个毒株之间(表5)，SDLY0701与SDLY0702和SDIB702/2012抗原相关系数分别为13%和35%，但与其他5个毒株之间抗原相关性为0；而CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD10/003和SDIB669/2012等4个毒株之间抗原相关系数均为100%。与此类似，同属于Ⅱ型的SDWF0608与Ma5抗原相关系数均为25%，但SDLY0701与Ma5之间相关系数为0。

基于S1基因序列的基因分型与血清分型结果不一致。如Mass基因型分离株SDTA06111与H120、Ma5抗原相关性分别为13%和0，属于不同的血清型；而与QX基因型分离株SDLY0612、SDZB0808、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD10/001和CK/CH/SD10/002的抗原相关性为25%～70%， 属于同一血清型的不同亚型。TC07-2基因型分离株CK/CH/SD09/005与QX基因型分离株SDLY0612、SDZB0808和SDIB702/2012之间抗原相关系数为35%～50%，属于同一血清型的不同亚型。

表5 与SDZB0808抗原相关系数100%的8个毒株之间抗原相关系数

Table 5 Antigenic relatedness values of 8 IBV isolates showingRvalues of 100% with SDZB0808

%

3 讨 论

3个疫苗株之间交叉中和试验结果显示，4/91与H120/Ma5之间不能交叉中和，抗原相关系数均为0，说明4/91与H120/Ma5之间没有共同的中和性抗原表位，但是3/18的IBV分离株(CK/CH/SD09/005、CK/CH/SD08/007和SDIB702/2012等)可以同时被4/91、H120和Ma5阳性血清中和，表明这些IBV分离株同时具有4/91、H120和Ma5部分中和性抗原表位。其中5个分离株(SDZB0808、CK/CH/SD09/001、CK/CH/SD09/003、CK/CH/SD09/002和CK/CH/SD10/003)阳性血清可以中和3个疫苗株和所有分离株，且对大部分异源病毒的中和效价与同源效价相同，表明这5个毒株的抗原谱较广，能够诱导交叉中和反应抗体。

部分IBV毒株之间一方面表现单向交叉中和反应，另一方面属于同一血清型的IBV毒株之间抗原相关性可能存在明显差异，表明IBV抗原的复杂性。这些特性也见于之前的相关研究，S.P.Mondal等研究发现IBV分离株 CU82805与DE072之间S1基因核苷酸相似性为96%， CU82805阳性血清可以中和DE072，但是CU82805不能被DE072阳性血清中和[10]。其他学者在对IBV进行血清分型时也发现了IBV毒株之间复杂的抗原关系。B.S.Cowen等通过单向鸡胚交叉中和试验对12株IBV进行分型时发现属于同一血清型的不同毒株之间抗原相关性存在差异[12]。R.W.Winterfield等发现同一血清型的不同毒株与其他血清型毒株之间的抗原相关性存在明显差异[13]。

虽然IBV中和性抗原表位位于S1蛋白上，但是基于抗原相关系数的IBV血清分型与S1基因分型结果并不一致。如SDTA06111和疫苗株H120、Ma5S1基因处于同一进化分支(Mass基因型)，但是SDTA06111与H120、Ma5属于不同血清型，而与QX基因型SDZB0808属于相同血清型的不同亚型。再如CK/CH/SD09/005属于TC07-2基因型，但与QX基因型毒株SDZB0808抗原相关性为50%，属于同一血清型的不同亚型。M.Li等采用鸡胚气管环单向交叉中和试验将广西26个IBV分离株和3个疫苗(4/91、H120和Ma5)分成7个血清型，同时对其S1基因高变区(HVR1)进行遗传进化分析，结果显示血清分型与基因分型结果符合率仅为57.7%[6]。IBV血清分型与S1基因分型结果不一致的原因可能在于：(1)S1蛋白上个别氨基酸的突变可能导致中和性抗原表位的改变，从而导致血清型的改变[14]；(2)虽然IBV中和性抗原表位主要存在于S1蛋白上，但其S2蛋白上也存在中和性抗原表位[15]。S1基因分型和血清分型分别反映了IBV在基因序列和抗原决定簇方面的差异，二者分类方法不同，其不一致性是可以理解的，类似的现象也见于人乙型肝炎病毒[16]。但C.H.Wang等对9个台湾分离株通过鸡胚交叉中和试验进行血清分型结果与S1基因分型结果一致[7]，原因可能在于毒株的数量有限。

目前，IBV中和试验采用的培养系统有鸡胚肾细胞空斑减少试验、鸡胚气管环和鸡胚中和试验。由于大多数IBV分离株在鸡胚肾细胞上不能产生明显的病变，多数学者采用鸡胚气管环或鸡胚中和试验进行IBV抗原性分析。在进行IBV血清分型时尚没有统一的参考标准。对于单向交叉中和试验，B.S.Cowen等认为如果32～320 EID50/TCID50的IBV毒株A能被20单位的毒株B阳性血清中和，就认为这两个毒株是一个血清型[12]，而M.Li等认为100 TOC-ID50的IBV毒株A被毒株B阳性血清中和的效价达到毒株B的同源效价，就认为这两个毒株血清型相同[6]。对于双向交叉中和试验，有的学者认为两个毒株抗原相关系数(R值)小于5%为不同血清型[7]，有的学者认为R值小于10%为不同血清型[11]，本研究采用双向鸡胚交叉中和试验，参考杨汉春的方法，采用R小于25%为不同血清型的划分标准[9]。由于同一血清型IBV毒株之间可能存在抗原性差异以及不同血清型毒株之间的抗原交叉性，双向交叉中和试验更有助于明确毒株之间的抗原相关性。另一方面，由于各个实验室进行血清分型采用的参考株不同，导致彼此的研究结果没有可比性，大大限制了血清分型在IBV流行病学研究中的应用。因此，有必要建立用于IBV流行株血清分型的标准参考株和阳性血清，使IBV的血清分型结果具有更为广泛的流行病学意义和参考价值。

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(编辑 白永平)

Antigenic Relatedness and Serotype of Infectious Bronchitis Virus Isolated in Shandong Province

HU Bei-xia1，XU Chuan-tian1，YANG Shao-hua1，HUANG Yan-yan1，ZHANG Lin1，HUANG Qing-hua1，HUO Ya-fei2，ZHANG Wei1，ZHANG Xiu-mei1*

(1.ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding，InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China；2.CollegeofAnimalScience，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

To clarify the epidemiology of infectious bronchitis virus (IBV) in Shandong province，the antigenic difference among field isolates and vaccine strains was studied.The monovalent antisera against 3 commercial IBV vaccine strains (H120，Ma5 and 4/91) and 18 field isolates were prepared in SPF chickens.The cross viral neutralization (VN) test was performed in SPF chicken embryos to determine the endpoint titers for homologous and heterologous neutralization.The serotype of IBV strains was determined based on antigenic relatedness values (ARV) calculated by the formulaR=r1×r2.As a result，vaccine strain 4/91 was belong to serotype I.Vaccine strain H120，Ma5 and two isolates (SDWF0608 and SDLY0701)were grouped in the same serotype.SDZB0808 and the other 15 isolates were grouped in the same serotype.CK/CH/SD09/006 and CK/CH/SD10/001 were in 2 other different serotypes，together with other 3 or 6 IBV isolates，respectively.Moreover，some IBV strains showed one-way neutralizing reaction with others and some IBV strains in the same serotype had different ARVs.The resultes indicate that the antigenicity of IBV strains is very complicated and there are evident antigenic difference between IBV isolates and 3 vaccine strains.

infectious bronchitis virus；cross neutralization test；antigenic relatedness value；serotype

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.015

2014-08-21

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-42-Z12)

胡北侠(1974-)，女，江苏东海人，博士，副研究员，主要从事禽病综合防控技术研究，Tel:0531-88970857，E-mail：hubeixia917@sina.com

*通信作者：张秀美(1956-)，女，江苏徐州人，研究员，主要从事禽病综合防控技术研究，E-mail：zxm820410@163.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)04-0615-09