益眠达片质量标准研究

2015-03-22胡卫东高永喜李卫兴曾凡波

中国药业 2015年2期

关键词：合欢皮五味子薄层

汪涛，胡卫东，高永喜，李卫兴，曾凡波

（1.中国人民解放军武汉疗养院，湖北武汉 430074； 2.华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉 430030）

益眠达片质量标准研究

汪涛1，胡卫东1，高永喜1，李卫兴1，曾凡波2

（1.中国人民解放军武汉疗养院，湖北武汉 430074； 2.华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉 430030）

目的建立益眠达片的质量控制方法。方法用薄层色谱（TLC）法对首乌藤、合欢皮进行定性鉴别；用高效液相色谱（HPLC）法测定益眠达片中五味子所含五味子醇甲的量，色谱柱为Shiseido Capcell Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇－水（55∶45），检测波长为250 nm。结果 TLC检出了首乌藤、合欢皮特征斑点；五味子醇甲进样量在0.118 9～1.189 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r＝0.999 9），加样回收率为98.55%，RSD为1.47%（n＝6）。结论所建立的质量控制方法简便、稳定、可靠，可作为该制剂的质量控制方法。

益眠达片；质量标准；高效液相色谱法；薄层色谱法

益眠达片为中国人民解放军武汉疗养院研制开发的纯中药制剂，于2011年取得军队医疗机构制剂临床研究批准文号（广L2011002），具有益气生津、安神补脑、镇静安眠的作用，用于治疗失眠、多梦、胸胁胀满、郁闷不舒、心烦心悸、头痛健忘、神经衰弱、抑郁、焦虑等症。为更好地控制产品质量，对首乌藤和合欢皮进行了薄层色谱（TLC）鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法对方中五味子中的活性成分五味子醇甲进行了含量测定，为该制剂建立完善的质量标准提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪，包括HP－1110四元泵，HP－1110 DAD检测器，HP Chemstation化学工作站（Agilent公司）；电子天平（CP225D，1／10万）；KQ－500B型超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。硅胶H薄层板、硅胶G薄层板均由青岛海洋化工厂分厂提供。五味子醇甲对照品（供含量测定用，批号为110857－200405）、大黄素对照品均由中国药品生物制品检定所提供；益眠达片（批号分别为 130513，130407，130314，由中国人民解放军武汉疗养院提供）。甲醇为色谱纯（Lanscanltd），水为纯水机净化水（纯水机型号Millipore Milli－Qbiocel），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

首乌藤：取本品10片，研细，加乙醇50 mL，超声处理30 min，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。取大黄素对照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。另取缺首乌藤的模拟片20片，按供试品溶液制备法制备阴性对照品溶液。照TLC法［1］试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶H板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点（见图1）；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。

合欢皮：取本品10片，研细，加50%甲醇30 mL，浸泡1 h，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇5 mL使溶解，用正丁醇振摇提取2次，每次5 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取合欢皮对照药材1 g，同法制成对照品溶液。另取缺合欢皮的模拟片20片，按供试品溶液制备法制备阴性对照品溶液。照TLC法［1］试验，吸取上述3种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－甲酸（13∶5∶2）的下层溶液（每10 mL加甲酸0.1 mL）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇试液，在90℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点［2］，见图2。

图1 首乌藤薄层色谱图

图2 合欢皮薄层色谱图

2.2 五味子醇甲含量测定［3－7］

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Shiseido Capcell Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－水（55∶45）；流速：1.0 mL／min；检测波长：250 nm；柱温：40℃［3］。分离度（R）大于1.5，理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于3 000。

2.2.2 溶液制备

精密称取五味子醇甲对照品15 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液（每1 mL中含五味子醇甲60 μg）。取本品20片，研细，置分液漏斗中，用乙醚提取4次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按样品处方制备缺五味子的模拟样品，精密量取10 mL，按拟订方法制备阴性对照品溶液。将上述3种溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，得色谱图（见图3）。可见，供试品溶液与对照品溶液在相应位置上有相似峰，而阴性对照品溶液则无此峰出现。

2.2.3 方法学考察

图3 高效液相色谱图

标准曲线制备：精密称取五味子醇甲对照品14.86mg，置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得59.44 μg／mL五味子醇甲对照品溶液，分别吸取2，4，6，10，20 μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以五味子醇甲对照品溶液进样量（X）为横坐标、峰面积值（Y）为纵坐标绘制标准曲线［3］，得回归方程 Y＝1.976×106X＋6.830×103，r＝0.999 9（n＝5）。结果表明，五味子醇甲进样量在0.118 9～1.189 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密量取同一对照品溶液10 μL和供试品（批号为130513）溶液各10 μL，按拟订色谱条件重复进样6次。结果五味子醇甲色谱峰平均峰面积为1134196，RSD为0.47%（n＝6），供试品色谱峰平均峰面积为1 452 514，RSD为0.31%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品（批号为130513）溶液10 μL，分别于配制后0，1，4，8，15，24 h的依法测定。结果的 RSD为1.63%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为130513）溶液6份，精密量取10 mL，分别依法制备供试品溶液，并进样测定。计算得五味子醇甲的平均含量为0.064 g／L，RSD为1.27%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验［7］：精密量取已知含量的同一批样品（批号为130513，含量为0.063 52 g／L）5 mL，精密加水5 mL，混匀，再精密加入五味子醇甲对照品（0.273 0 g／L）乙醚溶液20 mL，振摇提取，分取乙醚层，水层溶液继续用乙醚振摇提取3次，每次20 mL，合并4次乙醚提取液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液，依法进样测定含量并计算回收率。结果见表1。

表1 五味子醇甲加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，采用外标法计算五味子醇甲的质量分数。结果批号为 130513，130407，130314的3批样品中五味子醇甲含量分别为每片 0.063，0.055，0.057 mg，平均含量为每片0.058 mg。

3 讨论

益眠达片由合欢皮、首乌藤、生地、熟地、五味子等药组方。合欢皮甘平，入心、肝、脾经，有解郁安神之功，《神农本草》谓合欢有“安五脏，和心志，令人欢乐无忧”之说，其所含皂苷、鞣质等有镇静作用，用于愤怒、忧郁所致失眠、虚烦不安。首乌藤甘、苦、涩，微温，入肝、肾经，有补肝肾、益精血、养心安神、养血通络的作用，用于阴虚血少之须发早白、眩晕目眩、腰膝酸软乏力者，常与熟地黄同用。现代药理学研究表明，首乌藤和根茎含蒽醌类，主要为大黄酚、大黄素、大黄素甲醚等蒽醌类化合物，主要用于心神不宁、失眠多梦［8］。生地甘、微苦、寒，入心、肝、肾经，寒性较大，汁液较丰，长于清热凉血生津、滋阴补肾。熟地甘、微温，入心、肝、肾经，滋阴补血，治阴虚血少、腰膝痿弱［9］。五味子具有润肺、止汗、滋肾、涩精的功效，能够增强机体免疫力，抑制机体中枢神经系统［10］。诸药合用，共奏滋阴养血、清热解郁，宁心安神之功效。

按本品处方比例及制备工艺分别制备不含首乌藤、合欢皮的缺味样品并制成阴性对照品溶液，分别与相应的供试品同板进行薄层色谱试验。结果，各阴性对照均无相应斑点，该2味药的鉴别方法具有专属性。

本研究中，采用TLC法对益眠达片中首乌藤、合欢皮2味药材进行鉴别，并采用HPLC法对方中五味子中的活性成分五味子醇甲进行含量测定，方法简便，专属性和重复性好，且结果稳定，可用于益眠达片的质量控制。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅥB 34.

［2］何远楼.清热祛湿颗粒的薄层色谱鉴别［J］.中国药业，2012，21（4）：49－50.

［3］古海锋，刘然，张小茜，等.安神健脑液质量标准研究［J］.中国中医药信息杂志，2010，17（2）：50－52.

［4］唐晓蓉，余敏灵.反相高效液相色谱梯度洗脱法测定安神补心片中丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量［J］.中国药业，2012，21（4）：46－47.

［5］华彬，毛春芹，陆兔林.莪术饮片质量标准研究［J］.中国药业，2012，21（4）：28－30.

［6］黄丹莹，李惠敏.抗骨增生片质量标准的研究［J］.中成药，2010，32（6）：1 073－1 076.

［7］陈学松，刘慧妍.阳春片的质量标准研究［J］.中国现代应用药学，2010，27（3）：263－265.

［8］翟学佳，刘金梅，史芳，等.健脑合剂的质量控制方法研究［J］.医药导报，2012，31（4）：483－485.

［9］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：2 626.

［10］张秀恩.64例参芪五味子治疗失眠患者的临床疗效分析［J］.北方药学，2012，9（1）：53－54.