余 昳，刘长庭

解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853

DNA处理蛋白A在细菌自然转化中的作用

余 昳，刘长庭

解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853

自然转化是水平基因转化的一种基因编程机制，是细菌通过水平基因转移获得新的遗传信息的一种途径。DNA处理蛋白A(DNA processing protein A，DprA)是一种保守蛋白，它参与自然转化的多个环节，可以结合单链DNA并保护其免受核酸酶损伤；与重组酶A相互作用，利于重组酶A装载到裸露的单链DNA及被单链DNA结合蛋白覆盖的单链DNA上，随后进行染色体同源搜索及配对，可以减弱单链DNA结合蛋白的屏障作用，通过限制感受态刺激因子的早期基因表达，参与细胞感受态的关闭过程。本文对DprA蛋白在细菌自然转化中的作用进行综述。

DNA处理蛋白A；细菌；自然转化

自然转化是一种重要的生物学现象，它是细菌水平基因转化的一种基因程控机制。不同于转导或接合等其他机制，它利用DNA摄取泵导入DNA，不需要额外染色体或移动因子[1]。细菌自然转化的意义：抗药性基因在病原菌之间快速水平转移，以自然转化过程中摄取的外源DNA为模板，通过同源重组方式修复受损染色体，是维持遗传多样性、促进细菌进化的一种途径。自然转化过程需要重组酶A、单链DNA结合蛋白、DNA处理蛋白A(DNA processing protein A，DprA)；其中DprA在自然转化过程中有重要作用[2]。1995年Karudapuram等[3]在流感嗜血杆菌中首次发现DprA并命名，本文从结构、功能、研究、展望等方面对其进行综述。

1 DprA的结构

1.1 DprA的单体结构 DprA是一中广泛分布的细菌蛋白，在317株完全测序细菌基因组中85%存在DprA[4]。它由约300个氨基酸组成，不同菌种的DprA所含氨基酸数略有差异。这些氨基酸构成山姆结构域(SAM)、DNA-processg-A区和果蝇美里样蛋白1(DML1)区(图1)[5]。DprA的二级结构由9个α螺旋和9个β链组成一个经典的罗斯曼折叠(图2)[5]。

1.2 DprA二聚体的结构 研究表明，DprA自身形成二聚体后，才能结合单链DNA，进而帮助重组酶A装载到单链DNA上，完成后续转化过程[6]。DprA主要靠残基Pro183、Leu196和Phe205的分子间疏水作用形成二聚体，此外残基Arg185和Glu188之间的四个氢键加强了这个二聚作用(图3)[5]。

1.3 DprA与单链DNA的结合模型 幽门螺杆菌的DprA上有两个小的带正电荷的结合口袋，这两个结合口袋有经典罗斯曼折叠，DprA二聚体通过这两个口袋结合单链DNA。残基Arg52可以调整开放的口袋，以容纳一个单链DNA的基底，使得DprA牢固地抓住单链DNA的基底。经凝胶迁移滞后实验和静态光散射测量，这个模式为DprA与单链DNA摩尔比为1∶1的低聚物[5]。而肺炎链球菌的DprA-单链DNA是直接聚合体[4]。

1.4 DprA二聚体与重组酶A的互作模型 根据体外单分子研究，重组酶A单体折叠成3个域，有3个残基，可以对接DprA，其核心区域包含ATP结合位点，朝向核蛋白丝的内部，有两个无序环作为单链DNA结合位点的一部分[7]。重组酶A的C末端区域位于核蛋白丝的外表面，结合单链DNA。N末端区域折叠成一个α-螺旋，对着核蛋白丝的邻亚单位，这个α-螺旋通过一个长链接与核心区域连接[8-9]。近期研究表明，在DprA二聚体和重组酶A互作界面有一个重叠区，DprA-DprA同源二聚体被DprA-重组酶A异源二聚体替代，使得重组酶A可以在DNA上成核并聚合，随后进行染色体同源搜索及配对[6]。

图 1 3种同源DprA的序列比对 (Rp-枯草杆菌、Sp-肺炎链球菌、Hp-幽门螺旋杆菌)[5]★二聚体界面的疏水残基； ●结合口袋的保守残基； ▲单链DNA的结合残基Fig. 1 Sequence alignment of three homologous DprA proteins (R. palustris, S. pneumonia and H. pylori.)

图 2 DprA的二级结构 (9个α螺旋和9个β链)[5]图 3 DprA二聚体结构[5]Fig. 2 Secondary structure elements of DprA monomerFig. 3 Dimer of DprA

2 DprA的功能

在60多个自然转化感受态细菌中，枯草杆菌和肺炎链球菌被作为革兰阳性菌的自然转化模型，而淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌则是革兰阴性菌的模型。通过研究这些细菌，发现自然转化一般分3步：外源DNA结合到细菌表面；运输外源DNA穿过细胞膜；供体DNA同源重组到受体染色体或质粒上[10-11]。另外，研究还发现DprA参与自然转化的多个环节：结合线形和环形单链DNA，保护单链DNA免受核酸酶损伤；与重组酶A相互作用，利于重组酶A装载到裸露的单链DNA及被单链DNA结合蛋白覆盖的单链DNA上，随后进行染色体同源搜索及配对；减弱单链DNA结合蛋白的屏障作用；限制感受态刺激因子的早期基因表达，参与细胞感受态的关闭过程。

2.1 DprA保护单链DNA免受核酸酶降解 枯草杆菌DprA和肺炎链球菌DprA都具有显著的单链DNA结合活性，基本对于双链DNA没有亲和力，与单链DNA结合蛋白相比，尽管DprA不打开单链DNA二级结构，但它聚集在DNA易接近的细胞极区域[4]。DprA和重组酶A交替出现在细胞极上，DprA在细胞极上时重组酶A在细胞中心。DprA结合了DNA后从细胞极移到细胞中心，此时重组酶A回到细胞极上，结合了DNA后的重组酶A再从细胞极移到细胞中心[12]。在DprA缺失的感受态细胞中，内化的DNA被完全毁坏，表明DprA在保护单链DNA免受核酸酶降解过程中起着重要作用[2]。通过纯化并标记DprA蛋白的方法发现，DprA结合线形和环形单链DNA，可以保护单链DNA免受各种核酸酶降解[4]。

2.2 DprA促进重组酶A装载于单链DNA 重组酶A是基因转化必需的，可以催化DNA的连接[13]。重组酶A在同源重组过程中起着DNA重组修复、诱导细胞应急反应、重启复制叉的作用，所有这些活性需要在单链DNA上加载重组酶A，形成重组酶A-ATP-单链DNA核蛋白丝才能发挥作用[2]。Mortier-Barr iè re等[4]在从肺炎链球菌感受态细胞中纯化C末端组氨酸被标记的重组酶A时，同时获得了DprA，证明了这两个蛋白存在相互作用。它们还通过酵母双杂交试验证实了枯草杆菌DprA和肺炎链球菌重组酶A以及肺炎链球菌DprA和枯草杆菌重组酶A之间的跨物种的相互作用[4]。体外实验表明，DprA促进DNA结合，利于重组酶A装载到裸露的单链DNA上，由此产生DprA-重组酶A-单链DNA核蛋白丝，使得同源DNA分子连接起来。较之双链DNA，DprA更易于结合单链DNA并与重组酶A互作，利于重组酶A装载到单链DNA上形成核蛋白丝结构，激活重组酶A上的单链DNA依赖的ATP酶活性，触发重组酶A催化的同源底物之间平行和螺旋连接[4]。

2.3 DprA减弱单链DNA结合蛋白屏障 单链DNA结合蛋白可以促进转化，其缺失使得转化减少了3 ～ 5倍[2]。通常单链DNA结合蛋白结合并瓦解单链DNA的二级结构[14]。但当DprA结合单链DNA后，利于从单链DNA上解除一部分单链DNA结合蛋白[15]。研究表明，重组酶A上存在着单链DNA依赖的ATP酶，当单链DNA被饱和数量的单链DNA结合蛋白覆盖后，单链DNA依赖的ATP酶活性被减弱，而增加DprA的数量可以竞争性地还原这些ATP酶的活性，证明DprA抵消了单链DNA结合蛋白对这些ATP酶的抑制作用[4]。DprA抵消了单链DNA结合蛋白屏障时，单纯的重组酶A核丝形成；单链DNA结合蛋白缺失时，混合的DprA-重组酶A核蛋白丝形成。Mortier-Barrière等[4]借助透射电子显微镜观察DprA与被单链DNA结合蛋白覆盖的单链DNA之间相互作用，发现DprA结合到单链DNA结合蛋白-ssDNA复合体上，这样利于重组酶A核链装载到被单链DNA结合蛋白覆盖的单链DNA上。DprA的存在克服了单链DNA结合蛋白对重组酶A装载的抑制作用，利于重组酶重组酶A介导有单链结合蛋白单链DNA结合蛋白存在的DNA链交换[4]。

2.4 DprA参与细胞感受态的关闭 自然转化中感受态是必不可缺的环节，绝大多数能够自然转化的细菌感受态期十分短暂，突然开始又迅速结束，感受态调控机制复杂[16]。感受态是受ComE蛋白调控，ComE蛋白的反馈调控子被磷酸化后，激活感受态特性σX因子，使得感受态刺激因子水平升高，导致所有的细胞变成感受态[17]。研究表明，受σX因子控制的DprA与ComE～P蛋白相互作用，阻碍ComE蛋白转录表达，影响σX因子产量；扰乱DprA与ComE蛋白的互作，可以加速感受态的关闭[18]。

3 展望

肺炎球菌和枯草杆菌的DprA基因存在于感受态诱导的调节子中[4,19-20]。在肺炎球菌中，感受态仅持续一段极短的时间，而DprA只在这个极短的时间内被表达[18]。但在荚膜红细菌中，DprA在稳定期被表达[21]。早期研究认为，DprA只结合单链DNA不结合双链DNA[4]。然而，近年来在研究幽门螺杆菌中发现，DprA既结合单链DNA也结合双链DNA，被DprA覆盖的单链DNA和双链DNA可以免受核酸酶降解，而且双链DNA被甲基化而强化，从而认为DprA可以减弱幽门螺杆菌自然转化的限制屏障[19]。DprA有助于重组酶A介导的自然转化，但对同源重组并不是必不可少[4,22]。近期有研究指出，在荚膜红细菌中，DprA同源体可以影响细菌的同源重组接受能力，而且发现，所有产GTA的细菌中都具备这种DprA同源体。虽然DprA是一种保守蛋白，我们通过全基因组、蛋白组及转录组的测序比对，发现暴露于太空环境后的屎肠球菌中DprA基因出现突变[23]，这为DprA的研究提供了一个新思路。

通过不断研究，DprA的作用逐渐被人们所认识。DNA处理蛋白A参与细菌自然转化的多个环节，在抗药性基因在病原菌之间的转移中发挥重要作用，如保护单链DNA免受核酸酶降解、促进重组酶A装载于单链DNA、减弱单链DNA结合蛋白屏障、参与细胞感受态的关闭。借助于空间搭载技术，我们将更深入地了解DprA在细菌自然转化中的作用，能否以DprA为药物靶点从而改变细菌对抗药基因自然转化的能力，是值得我们密切关注和深入研究的课题。

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Role of DNA processing protein A in natural transformation of bacteria

YU Yi, LIU Changting
Department of Respiratory Diseases in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LIU Changting. Email: changtingliu@sohu.com

Natural transformation is a genetically programmed mechanism of horizontal gene transfer in bacterial, which is a way for bacteria to obtain new genetic information. DNA processing protein A (DprA) is a conserved protein, which is involved in multiple aspects of natural transformation: DprA can bind and protect ssDNA, interact with RecA, promote the loading of RecA on ssDNA, alleviate the SSB barrier, and it also involves in the closing process of competent cells. In this article, the role of DprA in the natural transformation of bacteria is reviewed.

DNA processing protein A; bacteria; natural transformation

Q 933

A

2095-5227(2015)10-1052-04 DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2015.10.024

时间：2015-06-12 10:02

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150612.1002.001.html

2014-08-07

国家“973”重点基础研究发展规划项目(2014CB744400)；国家自然科学基金项目(81350020)；全军医学科研“十二五”课题重点项目(BWS12J046)；载人航天领域项目(040203)

Supported by National“ 973” Program for Basic Science Research Development of China (2014CB744400); National Natural Science Foundation of China (81350020); Military Special-purpose Program of "Twelfth Five-Year"(WS12J046); Program of Manned Spaceflight(040203)

余昳，女，博士，主治医师。研究方向：呼吸病学、微生物学。Email: yiyu2016@163.com

刘长庭，主任医师，教授，博士生导师。Email: changti ngliu@sohu.com