冯英楠 陈 菲 张 鹏 庄 伟 林晓兰 王秀娟

(1 首都医科大学中医药学院,北京,100069; 2 首都医科大学宣武医院,北京,100053)

优化治疗神经胶质瘤复方抗瘤丸的实验研究

冯英楠1陈 菲2张 鹏2庄 伟2林晓兰2王秀娟1

(1 首都医科大学中医药学院,北京,100069; 2 首都医科大学宣武医院,北京,100053)

目的:通过实验研究,优化治疗神经胶质瘤中药复方抗瘤丸(KLW)的组成,得出最佳处方配伍。方法:采用大鼠神经胶质瘤C6细胞BALB/c裸鼠移植瘤模型,将模型裸鼠按瘤块体积随机分为10组(模型组,阳性药对照组(替莫唑胺TMZ组),KLW-1、KLW-2、KLW-3、KLW-4高、低剂量组,每组7只裸鼠。)连续给药15 d,检测各组裸鼠体重、瘤块体积、瘤块重量、微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)、凋亡细胞、Bcl-2,Bax蛋白表达水平。结果:与模型组比较,KLW-1高、低剂量组,KLW-2、KLW-4高剂量组,TMZ组瘤体积显著减小(P<0.05);KLW-4高剂量组,TMZ组移植瘤的MVD值明显降低(P<0.05);KLW-2、KLW-4高剂量组,TMZ组移植瘤VEGF灰度值明显增高(P<0.05);KLW-1、KLW-2、KLW-4高剂量组,TMZ组细胞凋亡率显著增高(P<0.05);各给药组Bcl-2/Bax的比例增加。结论:处方KLW-1高、低剂量组,KLW-2、KLW-4高剂量组对C6移植瘤的生长具有较好的抑制作用。

抗瘤丸;神经胶质瘤;处方优化

胶质瘤是中枢神经系统最常见的一类肿瘤,约占脑肿瘤32.8%～54.9%。这类肿瘤治疗困难,生存期短,死亡率高,对人类健康威胁极大。流行病学显示,目前我国神经胶质瘤患者约为20余万,每年新发病例3万余例。手术、放疗和化疗仍然是不同版本脑胶质瘤治疗指南所坚持的总原则[1-2],但治疗效果往往差强人意。中药复方抗瘤丸(KLW)因其较好的安全性和一定的有效性在该肿瘤的治疗中发挥了积极作用。KLW是由白花蛇舌草、半枝莲、白英等18味中药组成的中药复方院内制剂,主要功效为利湿解毒,扶正培本,活血化瘀。用于胶质瘤之湿热藴毒证,临床以头痛、眩晕、视物不清,或兼呕吐,舌紫暗或有瘀斑,脉沉或沉细等为特征,适用于脑胶质瘤、脑垂体瘤等见上述表现者的辅助治疗。临床应用近30年,服用的患者累计10万余人次。回顾性研究表明,KLW可抑制胶质瘤细胞的增殖,延长恶性胶质瘤患者的生存时间,具有肯定疗效[3],且价格低廉,有较好的开发价值和前景。本研究旨在前期体外细胞实验的基础上,运用中医学理论作指导进行处方筛选,为临床应用和处方优化提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 药物 复方制剂抗瘤丸1、2、3、4组(KLW-1、KLW-2、KLW-3、KLW-4)由首都医科大学宣武医院药剂科提供,替莫唑胺(批号:H20080313),购于美国先灵葆雅制药公司。

1.2 动物 BALB/c裸小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2012-0001。

1.3 仪器 6500型CO2培养箱(美国NAPCO),TE2101L型电子天平(德国赛多利斯),电子数显卡尺(中国广陆),倒置显微镜(日本OLYMPUS),DM3000显微镜(德国Leica)。

1.4 试剂 CD34抗体,兔抗人原始造血细胞单克隆抗体(北京中衫金桥生物技术有限公司,批号:12620110);VEGF抗体,rabbit IgG(武汉博士德生物工程有限公司,批号:10CM199);二抗,(H+L)/HRP辣根酶标记山羊抗兔(北京中衫金桥生物技术有限公司,批号:K126816A);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号:12469600);Bcl-2抗体,rabbit IgG,(26kDa,北京中衫金桥生物技术有限公司,批号:B1312),Bax抗体,rabbit IgG,(21kDa,武汉博士德生物工程有限公司,批号:BA0315),二抗,辣根酶标记山羊抗兔(北京中衫金桥生物技术有限公司,批号:101964)。

1.5 方法

1.5.1 处方筛选 复方制剂KLW-1,是18味中药组成的原方院内制剂。君臣药味基本不变,根据中医药理论及临床实践经验,按照功效、配伍意义将佐使药分为清热解毒、活血化瘀、化痰散结3组,同类药进行筛减,得到3个待选处方。分别形成由9味药组成的KLW-2方、由10味药组成的KLW-3方和由12味药物组成的KLW-4方。

1.5.2 模型制备 培养足够量的C6细胞以建立裸鼠体内移植模型。取对数生长期的C6细胞,0.25%胰酶消化后,PBS漂洗2遍,离心,用无血清的DMEM培养基重悬细胞。裸鼠接种时体重范围为19.0～22.8 g,周龄为6～8周,将细胞悬液注射至裸鼠右侧腋窝,0.2 mL/只,保证5×106个细胞一次性注射至裸鼠右侧腋窝。

1.5.3 分组、给药 待裸鼠体内瘤块长到300～1 000 mm3时按瘤块大小分组,使每组动物的瘤块大小平均值接近。分组后立刻按25 mL·kg-1灌胃给予受试药物,模型组给予同体积的去离子水。每天1次,连续给药15 d后处死裸鼠。KLW-1、KLW-2、KLW-3、KLW-4高、低2个剂量组(3.4 g生药·kg-1、0.85 g生药·kg-1)。阳性对照药(替莫唑胺胶囊)43 mg·kg-1。

1.5.4 指标检测 给药结束后处死裸鼠,取各组裸鼠的瘤块,称重。给药第0、3、6、9、12、15 d测量动物体重、肿瘤的最大直径(L)和最小直径(D),按如下公式:V=1/2×L×D2计算各组肿瘤体积V的大小;CD34免疫组化法染色,Weidner法计数微血管密度;VEGF免疫组化法染色,图像分析测定灰度值;TUNEL法检测凋亡细胞,计算肿瘤细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2,Bax蛋白表达。

2 实验结果

2.1 给药期间对裸鼠体重的影响 整个给药期间,各组动物体重均增长,各组裸鼠体重之间没有显著性差异。仅在给药第3 d,KLW-2低剂量组,KLW-4低剂量组和KLW-4高剂量组体重均显著高于模型对照组,(均P<0.05),表1。

2.2 给药期间对肿瘤体积的影响 给药3 d后,所有处方组移植瘤的体积均显著减少(P<0.05);给药6 d后,KLW-1高、低剂量组移植瘤的体积显著减少(P<0.05);给药9 d后,KLW-2高剂量组移植瘤的体积显著减少(P<0.05);给药12 d后,KLW-1低剂量组,KLW-2、KLW-4高剂量组移植瘤的体积显著减少(P<0.05);给药15 d后,KLW-1、KLW-2高、低剂量组,KLW-4高剂量组,阳性药对照组移植瘤的体积显著减少(P<0.05),表2。

2.3 给药15 d后各组裸鼠瘤重量比较 与模型对照组比较,KLW-1低、高剂量组,KLW-2高剂量组,KLW-4高剂量组,阳性药对照组移植瘤的重量显著降低(P<0.05),表3。

2.4 给药15 d后各组裸鼠肿瘤微血管密度(MVD)比较 倍镜下肿瘤的新生微血管染成棕黄色,与模型对照组比较,KLW-4高剂量组,阳性药对照组移植瘤的MVD值明显降低(P<0.05),表4、图1。

表1 抗瘤丸给药15 d对BALB/c雄性裸鼠体重的影响

注:与模型对照组比较，*P<0.05。

表2 抗瘤丸给药15 d对BALB/c雄性裸鼠肿瘤体积的影响

注:与模型对照组比较，*P<0.05。

表3 给药15 d各组裸鼠瘤重量比较

注:与模型对照组比较,*P<0.05。

表4 给药15 d各组肿瘤微血管密度比较

注:与模型对照组比较，*P<0.05。

图1 免疫组化CD34在C6移植瘤中的表达(DAB,×200)

注:1为模型组,2为阳性对照组,3为KLW-4高剂量组,4为KLW-2高剂量组,5为KLW-1高剂量组,6为KLW-1低剂量组。

2.5 给药15 d后各组裸鼠肿瘤组织中VEGF表达的差异 与模型对照组比较,KLW-4高剂量组,KLW-2高剂量组,阳性药对照组移植瘤VEGF阳性反应的灰度值明显增高(P<0.05),表5、图2。

2.6 给药15 d后各组裸鼠肿瘤细胞凋亡率的差异 模型对照组可见少量呈棕褐色的凋亡细胞,而KLW-4高剂量组,KLW-2高剂量组,KLW-1高剂量组,阳性药对照组可见大量的凋亡细胞,凋亡细胞核被染成棕褐色,表现为细胞核固缩,胞体缩小变形、破裂成小碎片或出现凋亡小体。与模型对照组比较,上述给药组细胞凋亡率显著增高(P<0.05),表6、图3。

表5 给药15 d各组肿瘤VEGF灰度值比较

注:与模型对照组比较，*P<0.05。

图2 免疫组化VEGF在C6移植瘤中的表达(DAB,×200)

注:1为模型组,2为阳性对照组,3为KLW-4高剂量组,4为KLW-2高剂量组,5为KLW-1高剂量组,6为KLW-1低剂量组。

表6 给药15 d各组肿瘤细胞凋亡率比较

注:与模型对照组比较，*P<0.05。

2.7 给药15 d后各组裸鼠瘤肿瘤细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的差异 Westernblot结果显示,模型对照组能明显下调Bax蛋白的表达,而KLW-1高、低剂量组,KLW-2高剂量组,KLW-4高剂量组和阳性药对照组,都能明显上调Bax的表达,模型组和各给药组的Bcl-2蛋白均呈低表达,图4。

3 讨论

流行病学调查显示,我国人群脑胶质瘤占全部脑肿瘤的44.6%。值得注意的是,近30年原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增,年增长率约为1.2%,老年人尤为明显。胶质瘤化疗领域最值得注意的当属新型烷化剂替莫唑胺[4],2009年成为NCCN指南推荐的治疗脑胶质瘤的一线用药。然而,替莫唑胺作为细胞毒类药物,具有骨髓抑制、消化道反应等,血小板减少和中性粒细胞减少的不良反应,很多患者因不能耐受而退出治疗。更为重要的是,就我国国情而言,替莫唑胺非常昂贵。与西药相比,中医药在治疗胶质瘤过程中注重辨证论治,整体调节。中医认为脑瘤属髓海病变,其成因多由痰湿之邪结聚于脑,脑部气滞血瘀,痰瘀阻滞,毒邪凝结所致。在其病变过程中痰瘀互结,脑络痹阻日久,化热动风,风火相煽,耗伤阴液,可致肝肾不足[5]。医院制剂KLW临床证明该药瘤体有效控制率达68.0%,可明显改善头疼头晕、恶心呕吐等症状[3]。除个别患者在服药初有腹部饱满不适以外,未出现血尿便常规异常,亦未见肝肾损伤,安全可靠,同时价格低廉,仅为替莫唑胺的1/30～1/50。

图3 TUNEL染色显示C6移植瘤中的凋亡细胞(呈棕褐色)(DAB,×200)

注:1为模型组,2为阳性对照组,3为KLW-4高剂量组,4为KLW-2高剂量组,5为KLW-1高剂量组,6为KLW-1低剂量组。

图4 Bax，Bcl-2在C6移植瘤中的表达

注:1为模型组,2为KLW-1低剂量组,3为KLW-4高剂量组,4为KLW-2高剂量组,5为KLW-1高剂量组,6为阳性对照组。

本实验结果显示,给药3 d后,抗瘤丸所有处方组对C6细胞移植瘤的生长具有明显的抑制作用,导致裸鼠移植瘤生长缓慢,可见中药复方KLW各处方组对胶质瘤的抑制作用起效快;给药第6 d后,KLW-1高、低剂量组对C6细胞移植瘤的生长具有明显的抑制作用，KLW-1治疗胶质瘤作用优势明显,低剂量即可抑制肿瘤生长;给药9 d后，KLW-2高剂量、给药15 d后,KLW-1低、高剂量组,KLW-2低、高剂量组,KLW-4高剂量组,阳性药对照组对胶质瘤生长有一定的抑制作用,移植瘤的体积明显小于模型对照组。

肿瘤发生的病理机制十分复杂,迄今为止尚未发现哪些因素可直接导致胶质瘤,根据分子病因学显示,其发生和发展与多种因素有关[6-8]，包括原癌基因活化、抑癌基因失活、凋亡相关基因异常、血管活性因子高表达、相关信号转导通路的激活等。与治疗靶点单一的西药化疗药相比,多靶点、多途径、多环节发挥抗瘤效应是中药的显著特点。目前研究认为,中草药及其活性成分抗胶质瘤的药理机制涉及多个方面[9]。包括影响胶质瘤细胞周期;抑癌相关基因的表达;调节机体免疫功能;抑制肿瘤血管生长;诱导肿瘤细胞分化;调节肿瘤细胞信号传导;抑制端粒酶活性和细胞毒作用等。

大量研究结果证实：实体肿瘤的生长和代谢需要持续的血管生长，肿瘤血管生成与肿瘤的生长、浸润、转移、分期及预后有密切关系。肿瘤微血管密度(MVD)是衡量肿瘤血管形成程度的标志,MVD检测有多个血管内皮标志物可以选择,其中CD34特异性强。目前研究认为血管的发生过程对于肿瘤的生长和转移起着重要作用，由于VEGF这种血管内皮细胞特异性生长因子在血管发生中起着重要的调节作用，在肿瘤组织内、外都可以大量分泌VEGF。Bax蛋白是一种促凋亡蛋白,而Bcl-2蛋白是一种抗凋亡蛋白,可抑制Bax蛋白的功能,通常Bcl-2/Bax蛋白的相对比例决定细胞的凋亡率,Bcl-2/Bax的比例增加,促进细胞的凋亡。

抗瘤丸是由18味中药组成的复方制剂,其主要抗瘤成分包括白花蛇舌草、半枝莲、白英,这些中药成分已有大量的药理学实验证明了其抗瘤机制。其中白花蛇舌草可改变肿瘤细胞周期分布,诱导细胞凋亡[10],诱导肿瘤细胞促凋亡基因的表达[11]。半枝莲可明显抑制bcl-2基因高表达[12-13],调节肿瘤VEGF[13]。白英可调节肿瘤细胞caspase基因表达,从而起到抗癌作用[14]。实验结果显示,KLW-4能够抑制血管内皮生长因子VEGF的表达,阻抑C6裸鼠移植瘤的血管内皮细胞增殖,降低微血管密度,从而产生抗肿瘤组织新生血管形成作用。同时,通过上调促凋亡蛋白Bax的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来促进肿瘤细胞凋亡。KLW-1和KLW-2不能通过抑制VEGF表达而产生抗肿瘤血管形成作用,主要通过促进Bax表达,促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述,KLW-1高、低剂量组,KLW-2高剂量组,KLW-4高剂量组,可抑制胶质瘤生长,对胶质瘤治疗有一定作用效果。下一步将建立人源裸鼠胶质瘤模型,与阳性对照药替莫唑胺比较,观察KLW-1,KLW-2,KLW-4抑制胶质瘤效果,进一步筛选处方,为临床应用提供依据。

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(2014-12-01收稿 责任编辑：王明)

Study on Optimization of KLW for Treating Glioma

Feng Yingnan1, Chen Fei2, Zhang Peng2, Zhuang Wei2, Lin Xiaolan2,Wang Xiujuan1

(1SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China；2XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053，China)

Objective:To optimize compound KLW, and screen for the best prescription. Methods: C6 cells in BALB/c nude mice transplantation tumor model was established, and then randomly divided into ten groups (the model control group, the TMZ group, and low, high dose KLW-1, KLW-2, KLW-3, KLW-4 group, each group including seven rats). The rats were orally administered with medication for 15days. The study measured weight of mice, the transplanted tumor volume and weight, MVD, VEGF, apoptotic cells, the Bcl - 2, Bax protein expression level. Results: Compared with model control group, low, high dose KLW-1, high dose KLW-2 and KLW-4 TMZ group of tumor volume significantly reduced(P<0.05); high dose KLW-4, TMZ group of tumor MVD decreased (P<0.05); high dose KLW-2 and KLW-4， TMZ group of tumor VEGF value increased (P<0.05); high dose KLW-1,KLW-2 and KLW-4, TMZ group of cell apoptosis rate increased (P<0.05); each dose group the Bcl - 2 / Bax ratio increases. Conclusion: Low and high dose of KLW-1and KLW-2, high dose KLW-4 have good effects on the growth of C6 transplantation tumor inhibition.

KLW; Glioma; Prescription optimization

北京市中医药科技项目(编号:JJ2010-12);卫生局215人才-领军人才(编号:303-01-005-0063);市科委-基地培育与发展工程专项(编号:303-01-004-0004-02);首都医科大学基础临床课题(编号:13JL71)

冯英楠(1988—),女,硕士,从事中药药效与作用机制研究,Tel:(010)83911624;E-mail:fengyingnan88@163.com

王秀娟,教授,博士生导师,从事中药药效与作用机制及中药资源可持续利用研究,Tel:(010)83911624;E-mail:wxj0517@sina.com;林晓兰,主任药师,从事中药制剂研发与医院药学管理,Tel:(010)83198684;E-mail:xllin83@163.com

R285.5;R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.026