张 晨 黄 进 詹 菲 张 进

(1 广州中医药大学基础医学院，广州，510006； 2 广州中医药大学门诊部，广州，510405)

黄芪多糖对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的保护作用

张 晨1黄 进2詹 菲1张 进1

(1 广州中医药大学基础医学院，广州，510006； 2 广州中医药大学门诊部，广州，510405)

目的：观察黄芪多糖(APS)对四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纤维化的治疗作用。方法：采用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，造模成功后，取大鼠血清和肝组织进行检测。测定血清肝纤维化四项、肝脏组织中羟脯氨酸(HYP)含量；HE染色比较炎症及肝纤维化程度；免疫组织化学法分析肝组织中I型胶原(Col-I)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)表达量。结果：与模型组相比，APS中、高剂量组的肝纤四项水平、炎症及肝纤维化程度明显降低(P<0.05)；APS中、高剂量组肝脏组织中HYP含量显著降低(P<0.01)；APS中剂量组Col-I、α-SMA表达显著减少(P<0.01)；APS高剂量组Col-I、α-SMA表达明显减少(P<0.05)。结论：APS对大鼠肝纤维化具有一定的防治作用，作用机制可能与其抑制Col-I、α-SMA表达有关。

肝纤维化；黄芪多糖；四氯化碳

近年来，中医药抗肝纤维化基础与临床研究成为医学界关注的焦点之一，其中作用机制的研究更是备受关注[1-3]。在抗肝纤维化的众多药物中，中药黄芪及其复方制剂是一类有很大发展潜力的药物。黄芪能够减少免疫损伤所致肝内胶原成分的异常沉积和调节相关信号通路转导[4-6]，对实验性肝纤维化有明显的治疗作用。黄芪多糖(APS)是黄芪主要生物活性成分。大量体内外实验及临床研究表明，APS具有增强机体免疫力、降压、降血糖、抗应激、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射和抗氧化等多种药理功效[7]。本实验基于CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，使用APS进行干预，以探究该药物对大鼠肝纤维化的防治作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠50只，雄性，体重180～220 g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(粤)2013-0020。

1.2 主要试剂和仪器 黄芪多糖(南京泽朗医药科技有限公司)；四氯化碳(天津富宇精细化工有限公司)；羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140605)；山羊血清封闭液(武汉博士德，批号：AR0009)；Col-I、α-SMA一抗(Abcam公司，批号：ab34710、ab5694)；二抗(基因科技公司，批号：GK600505)；智能生物组织脱水机(益迪YD-129)；石蜡包埋冷冻机(益迪YD-6L)；石蜡切片机(益迪YD-AB)；光学显微镜(OLYMPUS CX31)。

2 方法

2.1 模型制备和给药 SD大鼠50只按体重随机分成正常组、模型组、APS组(低、中、高)5组，每组10只。参照文献[8]，除正常组皮下注射花生油溶液外，其他各组大鼠由皮下注射60% CC14花生油溶液，首次注射5 mL/kg，以后以3 mL/kg每隔3 d注射1次，连续注射8周建立大鼠肝纤维化模型。APS组每天给予APS灌胃1次，低、中、高组剂量分别为0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg，正常组和模型组给予等体积的生理盐水。末次给药1 h后，水合氯醛麻醉大鼠，收集腹主动脉血和肝脏组织。

2.2 观察指标和检测

2.2.1 血清学指标分析 大鼠麻醉后腹主动脉取血约5 mL，3000 r/min离心15 min取血清，-20 ℃保存备用。全自动生化分析仪常规检测各组血清样本的肝纤维化指标：血清透明质酸(HA)，层黏蛋白(LN)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，Ⅳ型胶原(CIA)。

2.2.2 肝组织中HYP含量测定 称取肝脏湿重约50 mg，准确加水解液1 mL，混匀。严格按照羟脯氨酸检测试剂盒说明测定各管的OD值，根据计算公式：HYP含量(μg/mg)=(测定OD值-空白OD值)÷(标准OD值-空白OD值)×标准品含量(5 μg/mL)×水解液总体(10 mL)÷组织湿重(mg)，计算肝组织中的HYP含量。

2.2.3 HE染色 取大小约为1 cm×1 cm×1 cm肝组织，保存于10%甲醛溶液中。24 h后，开始脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，行常规HE染色。光镜下观察肝组织病理改变，随机选取10个100倍视野，观察并比较炎症及肝纤维化程度。

2.2.4 免疫组织化学染色分析肝组织中Col-I、α-SMA表达量 大鼠处死之后，取同一部位肝组织，大小为1 cm×1 cm×1 cm。组织样本处理：1)依次进行甲醛固定、不同浓度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡封片、切片、烤片；2)染色：二甲苯脱蜡15 min，重复3次，依次经乙醇(100%、95%、85%、70%、50%)脱水各5 min。3% H2O2、纯水漂洗各3 min。柠檬酸盐缓冲液修复，正常山羊血清封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，正常对照组以PBS代替一抗，平衡盐漂洗。二抗37 ℃孵育30 min，平衡盐漂洗。DAB染色，苏木精复染，去离子水迅速冲洗，0.1%盐酸酒精分化20 s。最后依次冲洗、脱色、透明、封片、干燥。染色结果以组织出现黄色或黄褐色为阳性。用已知阳性片作阳性对照，普通光学显微镜低倍镜确定阳性表达位置，移至高倍镜(×200)下拍摄病变组织5个视野照片，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，计算平均灰度值。

3 结果

3.1 模型制备及大鼠死亡情况 本次实验在第12、15周每组各处死1只大鼠用于HE染色，用于判定模型建立是否成功。实验期间大鼠共死亡5只，其中模型组2只，APS(低、中、高)组各死1只。大鼠死亡前活动度明显降低，进食减少，体重减轻，消瘦，考虑为CC14慢性中毒而死。

3.2 各组大鼠血清中肝纤维化四项含量变化 与正常组比较，模型组大鼠血清肝纤维化四项水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，APS中、高剂量明显降低大鼠血清中肝纤维化四项水平(P<0.05)。见表1。

3.3 肝组织中HYP含量变化 与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织HYP水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，APS中、高剂量显著降低大鼠肝组织中HYP水平(P<0.01)。见表1。

3.4 各组大鼠肝脏组织HE染色 正常组大鼠肝小叶结构清晰、完整，肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列，中央静脉汇管区动静脉和胆管结构正常，未见肝窦扩张，无胶原纤维，未见炎细胞浸润与胶原纤维增生；模型组大鼠肝组织正常肝小叶紊乱无序，肝细胞结构完全被破坏，可见纤维结缔组织明显增生，大部分肝细胞表现为片状坏死，形成大小不一的典型的假小叶结构，假小叶内以充斥着脂肪变的肝细胞为主，汇管区明显扩大，坏死细胞增多；APS组大鼠表现均轻于模型组，肝小叶样结构较模型组正常，未见假小叶形成，胶原纤维增生不典型。见图1。

3.5 各组大鼠肝脏组织中Col-I、α-SMA表达量的差别 正常组多呈低水平表达，染色淡，局部表达不明显；模型组多呈高水平表达，染色呈强阳性，染色多为棕黄色，广泛分布；APS中、高剂量组表达介于正常组与模型组之间，表达面积和强度较模型组显著为弱，纤维间隔染色淡。APS低剂量组阳性表达面积高于中、高剂量组，染色较深且广泛。将染色结果按照换算为显色指数，比较各组对肝组织Col-I、α-SMA表达的影响。与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织中Col-I、α-SMA表达量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，APS中、高剂量组大鼠肝脏组织中Col-I、α-SMA表达量显著降低(P<0.01，P<0.05)。见表2，图2、3。

表1 血清HA、LN、PCⅢ、CIA含量(ng/mL)和肝组织中HYP(μg/mg湿重)比较

注:与正常组比较，*P<0.01，与模型组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01。

表2 肝脏组织中Col-I、α-SMA表达量比较

注:与正常组比较,*P<0.01，与模型组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01。

图1 大鼠肝组织HE染色(×100)

注:A：正常组；B：模型组；C：APS低剂量组；D：APS中剂量组；E：APS高剂量组。

图2 大鼠肝组织Col-Ⅰ表达(×200)

注:A：正常组；B：模型组；C：APS低剂量组；D：APS中剂量组；E：APS高剂量组。

图3 大鼠肝组织α-SMA表达(×200)

注:A：正常组；B：模型组；C：APS低剂量组；D：APS中剂量组；E：APS高剂量组。

4 讨论

肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(ECM)的过度沉积，是机体对慢性肝损伤的一种修复反应，也是各种急慢性肝病共同的病理过程。CCl4皮下注射是建立肝纤维化模型的基本方法。本次实验大鼠皮下注射60%CCl4，8周后，造模大鼠逐渐表现为精神萎靡，行动迟缓，毛色干枯蓬乱发黄，体重明显下降，通过血清肝纤四项及肝组织HE染色分析，提示肝纤维化大鼠模型造模成功。本结果显示，APS各剂量组大鼠的肝纤四项、血清和肝组织中HYP含量以及病理纤维化程度均明显低于模型组，提示APS在一定程度上可抑制肝纤维化的进程。

肝脏中有多种蛋白，其中以Col-I为主。在正常肝脏中，胶原蛋白约占5%～10%，肝纤维化时胶原蛋白可占肝脏总蛋白的50%[9]。因此，Col-I是肝纤维化过程中ECM的主要成分。胶原主要经过转录、翻译、翻译后修饰，去除端肽及交联等合成。则作用于胶原合成的任何一个环节均有可能减少胶原在肝脏细胞外间质的沉积[10]，提示Col-I在肝纤维化的发生中发挥重要作用。HYP是一种非必需氨基酸，也是胶原代谢的重要产物。人体HYP占胶原蛋白比例最大，胶原蛋白是组织中胶原纤维的主要成分，胶原纤维广泛分布于人体各个组织。因此，胶原蛋白占人体蛋白质很大比例。我们根据HYP在胶原蛋白中含量最高这一属性，通过对肝组织中HYP的测定，可以了解肝脏中胶原蛋白的代谢情况，也可间接反映肝纤维化的程度和发展过程[11-12]。当肝脏受到损伤因素的不断刺激时，多途径共同激活肝星状细胞转化为肌纤维母细胞，并促使表达大量的α-SMA蛋白，导致肝脏内的ECM合成增多，而降解减少，造成胶原大量沉积，于是肝纤维化逐渐形成。所以，大量的α-SMA蛋白表达，在肝纤维化的形成中起关键性作用[13-14]。有报道显示[15]，α-SMA阳性细胞主要集中在汇管区、纤维间隔内以及窦周间隙的间质细胞，随着肝纤维化的发展，α-SMA阳性细胞数明显增多。因此，抑制α-SMA表达[16]、促进ECM的降解[17]与否是促进肝纤维化逆转非常重要的靶点。

本实验结果显示，APS中、高剂量明显抑制肝纤维化大鼠Col-I表达，且APS中、高剂量组大鼠肝脏组织中α-SMA表达量明显降低，表明APS抗肝纤维化的作用与其降低Col-I、α-SMA表达有关。APS可能是通过抑制Col-I、α-SMA表达，来抑制ECM的生成并促进ECM的降解，从而发挥保护肝脏和抗肝纤维化的作用。

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(2014-08-01收稿 责任编辑：张文婷)

Protective Effect of Astragalus Polysaccharide on Liver Fibrosis Induced by Carbon Tetrachloride in Rats

Zhang Chen1，Huang Jin2，Zhan Fei1，Zhang Jin1

(1BasicMedicalCollegeofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2GuangzhouUniversityofChineseMedicineclinics,Guangzhou510405,China)

Objective:To study the protective effect of the Astragalus polysaccharides (APS) on liver fibrosis in rats caused by carbon tetrachloride (CCl4).Methods:CCl4was used to induce rat liver fibrosis model. After making the model successfully, rat serum and liver tissue were collected to test. The serum liver fiber four and hydroxyproline (HYP) content in the liver tissue was tested; HE staining of liver tissue was used to compare inflammation and degree of liver fibrosis; expression of Col-I and α-SMA with immunohistochemical method was analyzed.Results:Compared with the model group, four levels of liver fibrosis, inflammation and liver fibrosis of APS high and medium groups were obviously lower(P<0.05); HYP content of APS high and medium groups were significantly lower (P<0.01); Col-I and α-SMA expression of APS medium group was significantly lower (P<0.01); Col-I and α-SMA expression of APS high group was obviously lower (P<0.05).Conclusion:The APS is effective to some extent in preventing liver fibrosis of rat, the functional mechanism may be related to limiting the expression of Col-I and α-SMA.

Liver fibrosis; Astragalus polysaccharides; Carbon tetrachloride

广州中医药大学高等学校博士学科点专项科研基金项目(编号：20114425120015)

张晨，男，陕西安康人，硕士研究生，研究方向：主要从事药效研究工作，E-mail：zhangchenak1990@126.com

黄进(1981—)，女，医学博士，主治医师，研究方向：主要从事药效研究工作，E-mail：huangin2010@gzucm.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.06.022