李球红，宋华东，周文怡，丁旭升，叶丽霞，庞基良

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036；2.杭州市园林绿化工程有限公司，浙江 杭州310020）

桂花（OsmanthusfragransLour.）又名木樨、九里香等，属于木犀科，木犀属，是中国传统十大名花之一［1］，也是杭州市的市花.我国桂花的栽培历史悠久，具有丰厚的文化底蕴.桂花四季常青，集绿化、美化、香化于一体，是我国重要的观赏及经济树种之一，它不仅具有较高的园林观赏价值，还具有一定的营养价值，桂花中的氨基酸含量高达13.8%.近年来有研究发现日香桂花中含有大量的类叶升麻苷［2］，升麻苷在解毒、抗炎、抑制核苷酸转运、抗病毒及抗骨质疏松方面具有药理活性.由于桂花的花期短、抗寒能力弱、长江以北难以栽培，培育花期长，且耐寒的桂花新品种是今后桂花育种中的长期课题［3］.桂花自秋季开花结实后，次年4～5月果实成熟，成熟后的种子需要经过一段时间的后熟作用，等到第二年才能萌发［4-5］，种子萌发至开花结实又需要数年.因此，桂花采用常规方法进行杂交育种，不仅进展缓慢且操作繁琐，难以达到目的.因此，利用现代生物技术培育桂花新品种具有重大意义.

目前国内外关于桂花组织培养的报道还不多，主要集中在子叶切块［6］、茎尖［7］、胚［8-9］等的离体培养上.本研究以4个桂花品种的幼胚为外植体进行组织培养，探讨了激素和继代对幼胚萌芽以及丛生芽形成的影响，为桂花的快速繁殖和新品种的培育提供了新的途径和方法.

1 材料与方法

1.1 材料

桂花的未成熟果实（图1，A）于3月上旬采自杭州市园林绿化工程有限公司桂花品种繁育中心.品种包括籽银桂、绿梗籽银桂、“庐州黄”籽银桂、莲籽丹桂.MS 培养基是植物组织培养常用培养基之一（1／2MS培养基即大量元素减半的MS培养基），TDZ（Thidiazuron）、NAA（Naphthaleneacetic acid）、PVP（Polyvinylpyrrolidone）的中文名分别为噻苯隆、萘乙酸、聚乙烯吡咯烷酮.

1.2 方法

1.2.1 外植体处理

去除果实的果肉，取出种子，剥去种子的种皮后，在超净工作台上用70%酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞灭菌3 min，无菌水冲洗4 次.然后用消过毒的刀片将种子切开，用无菌镊子把胚乳中的幼胚挑出来，接入幼胚培养基，每瓶接种4～7个外植体（图1，B）.

1.2.2 籽银桂的幼胚培养

设计两种籽银桂幼胚培养基，1号培养基为1／2 MS＋0.25 mg·L-1TDZ＋0.1 mg·L-1NAA；2号培养基为1／2 MS＋0.5 mg·L-1TDZ ＋0.1 mg·L-1NAA.均添加1.0 g·L-1PVP，20 g·L-1蔗糖，p H 值调至5.8.培养温度为23～25 ℃.幼胚暗培养30d后，转入光照下培养，每天光照14 h，光照强度1500～2000 lx.培养30d后记录幼胚存活率、愈伤化率、愈伤化状况.幼胚存活率的计算方法为最后存活的幼胚数除以接种的外植体数，愈伤化率为最后形成的愈伤块数除以接种的外植体数，愈伤组织的生长状况从大小、色泽方面观察.培养69d后统计萌芽率、幼苗平均高度.然后将萌发的幼苗切下分别转入1号和2号培养基，每隔40d左右继代1次.

1.2.3 不同品种桂花的幼胚培养

将“庐州黄”籽银桂、绿梗籽银桂、莲籽丹桂、籽银桂的幼胚接种在2号培养基上培养，培养条件与籽银桂幼胚方法相同.暗培养过程中分别统计桂花幼胚存活率，愈伤化率以及愈伤的生长状况.至愈伤组织形成后见光培养，然后每隔40d左右继代一次.继代培养4次后统计幼苗平均高度、平均丛生芽数.

2 结果与分析

2.1 激素对离体培养籽银桂幼胚存活及愈伤组织形成的影响

刚接种的籽银桂幼胚呈乳白色、小条状（图1，B），在培养基上培养30d后，幼胚从下胚轴的下端逐渐开始膨大，形成愈伤组织；培养69d后愈伤组织进一步膨大，且胚芽长大形成幼苗（图1，C）.由表1可见，1号培养基上的愈伤化率为97.7%，2号培养基上的愈伤化率为100%，且2号培养基上愈伤组织的生长状况优于1号培养基，由此可见两种培养基上的籽银桂愈伤化率都较高，但2号培养基更利于桂花愈伤组织的生长.

图1 离体培养桂花幼胚形成苗Fig.1 Shoots formed from the in vitro young embryo in Osmanthus fragrans

表1 激素对离体培养籽银桂幼胚存活及愈伤组织形成的影响＊Tab.1 Effect of hormone on the survival and formation of callus of in vitro young embryo in Osmanthus fragrans cv.ziyingui

2.2 激素对离体培养籽银桂幼胚萌芽及幼苗生长的影响

籽银桂幼胚在培养基上暗培养一个月后见光培养，愈伤组织上有幼芽分化出来，培养69 d后统计萌芽率及幼苗的平均高度，1号培养基上的萌芽率为33.3%，2号培养基上的萌芽率为50%，幼苗平均高度分别为0.9 cm 和1.2 cm.当籽银桂幼芽继代培养40 d后，形成生长健壮的幼苗（图1，D）.继代培养4次后，发现有丛生芽长出，且不同培养基上的平均丛生芽数不一样，1号培养基上的平均丛生芽数为2个（见表2），2号培养基上的平均丛生芽数为3个（图2，A）.2号培养基上的幼苗平均高度为3.9 cm，1号培养基上幼苗的平均高度为2.3 cm.由此可见适当提高TDZ的浓度有利于桂花幼苗的形成和生长.

表2 激素对离体培养籽银桂幼胚萌芽及幼苗生长的影响Tab.2 Effects of hormone on germination and shoot growth of in vitro young embryo in Osmanthus fragrans cv.ziyingui

2.3 离体培养不同品种桂花幼胚的生长发育

鉴于2号培养基更有利于桂花幼胚的生长，因此分别将“庐州黄”籽银桂、绿梗籽银桂、莲籽丹桂的幼胚接种到2号培养基上，暗培养30 d后形成大量愈伤组织，统计3个品种桂花的幼胚存活率.由表3可见，莲子丹桂幼胚在2号培养基上的存活率高达100%，其次是“庐州黄”籽银桂幼胚存活率为97.5%，绿梗籽银桂幼胚存活率为87.5%.光照培养时每40d继代一次，继代培养4次后，记录桂花幼苗株高及丛生芽数.绿梗籽银桂幼苗平均高度为2.8 cm，其次是“庐州黄”籽银桂幼苗平均高度为2.3 cm，莲子丹桂幼苗平均高度为2.2 cm.“庐州黄”籽银桂平均丛生芽数为3（图2，B），莲子丹桂平均丛生芽数为2（图2，C），绿梗籽银桂的平均丛生芽数为1（图2，D）.继代培养4次后测量统计2号培养基上4种品种桂花幼苗的株高.由此可见，相同激素配比培养基上不同桂花品种幼胚生长状况不同.

图2 离体培养不同品种桂花的幼苗Fig.2 The shoots formed from in vitro different varieties of Osmanthus fragrans

表3 离体培养不同品种桂花幼胚的生长发育Tab.3 The growth and development of in vitro young embryos of different varieties in Osmanthus fragrans

3 讨论

TDZ（Thidiazuron，噻苯隆）是一种新型的植物生长调节剂，具有极强的细胞分裂素活性，同时兼有一定的生长素活性，能促进侧芽及不定芽的发生［10］，它对木本植物的再生是最有效的［11］，能诱导月季［12］、杜鹃［13］叶片分化不定芽.桂花是一种难分化的木本植物，王珍华等［6］报道大花金桂子叶切块愈伤组织在分化培养基（1／2 MS＋0.5 mg·L-1TDZ＋0.1 mg·L-1NAA）上继代培养10 次后，不定芽分化率高达36%；宋会访等［14］报道桂花离体培养继代增殖的最适激素配方为0.5 mg·L-1TDZ＋0.1 mg·L-1NAA.通过本实验也进一步证实TDZ能有效诱导木本植物芽的分化.在一定范围内增大TDZ的浓度会提高桂花幼胚的出芽率，同时能促进桂花幼苗的生长和分化.本次实验中的2号培养基上的桂花幼胚生长状况普遍比1号培养基上的桂花幼胚生长状况要好.

本实验中不同品种桂花幼胚在同一种培养基上的生长状况差异较大，有的丛生芽较多，而有的较少，这可能是不同品种桂花本身遗传背景的差异造成的.桂花的繁殖周期较长，即使是离体培养幼胚也需要继代培养60d以上才能形成苗，是否有更好的激素配比或实验方法能让桂花大量快速地增殖值得进一步深入研究.

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［8］刘友全，梁茂厂，陈跃华.桂花离体胚的组织培养［J］.经济林研究，2008，26（2）：12-16.

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