王艳 刘艳丽

流行性感冒(influenza，简称流感)是由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，根据核糖蛋白抗原不同分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒。其中甲(A)型最常见，可广泛流行并人畜共患，同时会发生不定时的突变而衍生出新的病毒株，乙(B)型也会发生流行，但症状较轻，丙(C)型主要以散发出现，后两种病毒无再分亚型。流感病毒毒株抗原易变性是流感肆虐不止的关键所在，流感蔓延的机制虽未能完全破解，当前流感的防治是个尚未解决的难题，一些抗病毒药物中仅金刚烷胺和甲基金刚烷胺对甲型流感病毒有效，因其作用于甲型流感病毒的脱壳步骤，作用对象为M2蛋白。但这两种药物有较多的副作用，可引起中枢神经系统症状，因此必须慎用。目前接种流感疫苗是预防流感和控制其流行的一种最有效的措施。本文对当前流感疫苗的研究进程做简要回顾。

1 流感疫苗发展进程回顾及现状

1937年流感病毒在鸡胚中培养成功;

1941年美国首次批准使用流感病毒灭活疫苗;

1943年美国开始在军队中使用并证实有效;

1945年美国开始广泛应用;

1958年有人采用超速离心和层析技术研究成功进一步纯化的鸡胚全病毒灭活疫苗，多种裂解剂的研究使流感病毒裂解疫苗研制成功;

1968年裂解疫苗在美国首次被批准使用;

1976年英国首先在裂解疫苗基础上又研制出毒粒亚单位(HA和NA)疫苗;

1980年英国首次批准使用，灭活流感疫苗从而扩展到其他国家。

2003年美国批准在5至49岁健康人群中主动免疫接种减毒流感疫苗(LAIV)，流感活疫苗成为预防流感的一种重要新选择。

1.1 目前我国市场应用的流感疫苗

目前我国流感疫苗市场的疫苗有国产和进口裂解疫苗、适合于12岁以下儿童接种的亚单位疫苗、全病毒灭活疫苗(此疫苗不良反应较大，12岁以下儿童不能接种)三种类型［1-3］。

1.1.1 流感全病毒灭活疫苗:经国家药品管理部门批准的流感病毒接种鸡胚尿囊腔中，对收获的尿囊液进行灭活和无菌处理［4］，再采用离心或柱层析方法进行浓缩、纯化得到病毒原液，经过检测合格后进行包装即为流感全病毒灭活疫苗。由于其不良反应报道较多限制了其应用

1.1.2 流感病毒裂解疫苗:经国家药品管理部门批准的流感病毒株、在全病毒灭活疫苗基础上，将纯化后的病毒进行裂解，超滤浓缩后的单价病毒合并液可采用柱色谱法或蔗糖密度区带离心法进行纯化，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤后，并加入适宜浓度的硫柳汞作为防腐剂，根据各单价病毒原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行配制。所以，该类型疫苗的使用范围持续扩大，成为当前流感疫苗市场的主流。

1.1.3 亚单位型流感灭活疫苗:是在在裂解疫苗的基础上，通过加入恰当的裂解试剂并选择合适的裂解条件，将流感病毒膜蛋白毒粒亚单位(HA)和表面抗原(NA)裂解下来，然后进行纯化。亚单位型流感灭活疫苗进行人体接种后可以刺激机体产生相应的抗体，其免疫效果与裂解疫苗相同，且具有较好的安全性，可用于儿童。但亚单位型流感灭活疫苗不能使接种者产生分泌性球蛋白，且对异型病毒的感染效果较差。

1.2 我国尚未上市的流感减毒活疫苗 流感减毒活疫苗由美国率先研究并获得美国上市许可，其减毒活疫苗是三价冷适应流感病毒甲、乙型疫苗，由甲型H1N1、甲型H3N2和乙型病毒以相当的荧光聚焦单位(FFU)剂量组成。生产用毒株需要每年由国家卫生部门推荐的流行抗原进行匹配更新。该疫苗是通过一个简单的注射装置喷入鼻腔，易于操作，并且比需要注射使用的灭活流感疫苗更容易被儿童所接受。美国临床观察证明，该疫苗免疫原性和安全性与流感灭活疫苗相似，在儿童组中，其所对应的病毒株和变异株的免疫效果略优于灭活疫苗。流感减毒活疫苗的制备方式是用单独的疫苗毒种接种9～11 d的无特定病原体SPF鸡胚，产生大量的6∶2重配株的单价疫苗。通过2～3 d的培养后，收集鸡胚尿囊液，离心澄清并加入缓冲液稳定，得到大量的单价疫苗。按照配方，3种单价毒株和SPG溶液混合一定比例浓度并填充至喷鼻腔装置中。目前我国企业如中国生物技术、天坛生物等公司也在积极研究开发流感减毒活疫苗。

2 新型流感疫苗研发现状

新型的流感疫苗种类繁多，主要的研究方向将新型的流感疫苗简述为三类。

2.1 针对毒种变异方面开发的流感疫苗 多价疫苗的开发是个必然的趋势。流感疫苗从1978年前的“二价”苗到现在的“三价”苗已经历了35年。然而，自从2001-2002流感季节以来，2种不同的乙型流感(Victoria和 Yamagata)一直合并流行［5-9］，“四价”苗的出现，有助于预防两种A型病毒，并覆盖了第二种B型病毒株，保护针对2种A株和2种B株流感病毒株的感染，降低儿童、成人、老年人的发病率。证明多价疫苗研发的必然趋势。

毒株抗原性变异导致流感疫苗病毒株每年都需更换，但从1933年首次分离以来，M2蛋白的基因序列没有发生变化。而近来的研究表明，将M2蛋白通过杆状病毒载体在sf9细胞中表达，表达产物经腹腔注射BLAB/c小鼠，各项指标均表明，以M2为成分的流感疫苗可以保护小鼠免受同型或异型流感病毒的致死攻击。这就为科学家们提供了一个思路:用M2蛋白作为疫苗成分可预防所有的甲型流感病毒。

2.2 新的培养基质开发的流感疫苗 禽流感施虐对传统流感疫苗培养基质鸡胚供应的巨大冲击，使传统鸡胚培养的方式受到鸡胚来源不足的制约，难以在短时间内生产足够的疫苗以满足潜在流行或大流行的防控需求。改变传统的疫苗培养基质的研究工作一直在进行，利用鸡胚细胞、哺乳动物细胞以及人二倍体细胞进行流感病毒的培养研究均取得了较大的突破。MDCK细胞生产制备流感疫苗平台技术已经形成并正在推广［10］，采用细胞生产的疫苗在安全性和免疫性上与鸡胚法相当，而在经济性和时效性上则远远超出，显示了良好的发展前景。

基因工程疫苗大体分为四类，一类是利用基因工程方法删除与毒力有关的基因从而制备的基因缺失疫苗;另一类是将保护性抗原基因连接到相关载体上使之表达的载体疫苗;第三类是基因工程亚单位疫苗，HA基因工程疫苗是目前研究最多的基因工程亚单位疫苗;第四类疫苗为利用反基因操作技术制备的反基因工程疫苗。采用基因工程方法制备疫苗的技术日益成熟，使用该技术可以快速提炼有效成分，应用于疫苗生产。

2.3 针对提高疫苗安全性及免疫原性开发的流感疫苗 疫苗佐剂应用非常广泛，为提高疫苗的免疫原性并在流感大流行时节约抗原量，佐剂的应用得到国内外的认可。传统的疫苗佐剂仍是氢氧化铝和磷酸铝，但近年来，科学家们对疫苗佐剂的设计、研制和开发取得了许多进展，一些优秀的佐剂诸如MF59、LTK63、免疫刺激复合物(ISCOM)黏膜佐剂［11-13］、皂素佐剂等广泛应用于疫苗研究。各项研究表明，佐剂疫苗在流感流行的大环境下，是增加疫苗的供应量提高免疫效果一个非常明显有效的方法。

类病毒颗粒疫苗，最早，日本人称该类疫苗为virosome vaccine［14］，也可称之为 MDP-virosome vaccine。目前，很多生物技术公司采用基因工程等新技术进行该类疫苗的研发。美国Greffex公司宣布采用GREVAXTM技术，通过经改造的腺病毒载体，研发新型流感疫苗;Protein Science公司宣布采用杆状病毒表达载体系统技术［15，16］，研发新型流感疫苗;加拿大 Medicago公司宣布研制出H7N9病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)疫苗［17-19］。该类疫苗的多处于临床研究阶段，国内未见公开报道，同样也是国内流感疫苗市场未来几年研发的方向。

核酸疫苗是将编码一种免疫原基因的核酸克隆人表达载体［20］，该载体在细菌中扩增，质粒DNA纯化后用于机体免疫，在细胞中表达目的蛋白，引起机体的免疫应答。目前，流感疫苗的目的基因主要针对NP蛋白和HA，利用DNA重组技术，可直接提取HA DNA和NA DNA用于机体免疫，动物试验结果表明，核酸疫苗对保护动物抵御流感病毒的感染是一种既经济又有效的方法［21］，但该类疫苗在人体上的应用还需要长期周密的研究和评估。

十余年以来，我国先后经历了多次流感疫情的考验，从 2003年人感染 H5N1禽流感、2009年甲型H1N1流感大流行到此次H7N9禽流感疫情，无论国际还是国内，疫苗研发能力显著提高、研发周期明显缩短。然而，我国疫苗基础研究薄弱，技术储备不足，与欧美发达国家在创新能力、研发投入力度和技术水平等方面仍存在较大差距。我国人口基数大，卫生条件相对落后，又是流感大流行的主要爆发地，因此，及时研发新型疫苗，做好技术准备，以提高疫苗生产能力，这是防控潜在流行或大流行的关键措施，对保障公众健康、维护社会经济稳定具有重要意义。

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