何玉友，戚利潮，李海龙，边军英，高爱新

(1．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江富阳311400;

2．浙江省杭州市富阳区农业局，浙江富阳311400;3．浙江亚林生物科技股份有限公司，浙江富阳311400)

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生草本植物，具有益胃生津、滋阴清热等独特功效［1］，是我国传统名贵珍稀中药材。铁皮石斛种子极其细小，无胚乳，自然条件下需要和某些真菌共生才能萌发［2］，自然繁殖率极低，生长缓慢且生境要求独特，加上人为过度采集和自然生境破坏，目前我国野生铁皮石斛资源频临灭绝，已被列为国家二级保护植物［3］。随着植物组培技术的推广应用和设施栽培方法的不断改进，铁皮石斛现已实现人工规模化扩繁［4］，以不断满足日益增长的生产和消费需求。人工授粉是获取铁皮石斛繁殖材料和进行种质创制的主要途径，笔者在大棚设施栽培和附树仿生栽培条件下开展杂交、自交授粉试验和昆虫辅助授粉调查，以冷藏花粉授粉测定花粉活力，开展花粉粘着剂授粉对比试验，研究铁皮石斛授粉结实特性，以期为制定育种策略和生产实践提供理论依据和适用技术。

1 材料与方法

1．1 试验区概况 试验基地位于杭州市富阳区富春街道来龙山西麓城市森林公园入口处，地处 119°58′E、30°15′N，属亚热带季风气候，四季分明、雨量充沛、温和湿润，年均气温16．3℃，年均降水量1 479 mm，年日照时数1 759 h，无霜期约238 d，为铁皮石斛自然产地之一［5］。

1．2 试验材料 供试材料为种植年限在3年生以上的铁皮石斛大棚盆栽苗或附树仿生栽培苗，均起源于浙江野生种源实生组培苗，由浙江亚林生物科技股份有限公司提供。

1．3 试验设计

1．3．1 授粉方式。

1．3．1．1 同花授粉。在同一朵花内开展授粉。分别盆栽和附树2种不同栽培方式，每种栽培方式均重复2次。盆栽，每重复选取10盆，每盆授粉2个以上茎干、10朵花以上。梨树附生，每重复选取5丛，每丛授粉2个以上茎干、20朵花以上。

1．3．1．2 同序授粉。在同一花序内不同花朵间交叉授粉。每重复选取盆栽5盆，每盆授粉花序4个以上、花数不少于10朵、茎干多于2支。重复2次。

1．3．1．3 同枝授粉。在同一茎干上不同花序间相互授粉。每重复选取盆栽1盆，每盆选取5个以上茎干，授粉50朵花以上。重复2次。

1．3．1．4 同丛授粉。同一枝丛不同茎干间相互授粉。选取盆栽5盆，每盆选1丛，对其中3个以上茎干开展授粉，授粉花数多于20朵。

1．3．1．5 异花授粉。花粉块来自不同株丛。分别盆栽和附树2种方式，各重复2次，每重复5盆或5丛。盆栽，每盆授粉2个以上茎干、花数大于10朵。梨树附生，每丛授粉茎干2个以上、花数超过20朵。

1．3．1．6 自然授粉。分别不同栽培条件，在温室大棚内和野外不同附主(梨树Pyrusserotina Rehd、杜英Elaeocarpussylvestris(Lour．)Poir．)上，随机各选5 盆或5 丛，分别统计每盆或每丛的开花枝数和花朵量。

1．3．2 花序冷藏。采集刚开放2～3 d的新鲜花序放入塑料袋中，轻缚袋口置于4℃冰箱中冷藏。贮藏期间每天取花序进行授粉试验，同时选择相同开放程度的5盆植株作对照，每天从对照上采集花序进行授粉对比试验。

1．3．3 粘附助剂。任选植株1盆，每茎干仅保留中上部相邻2个花序，整盆授粉。上端花序均用75%酒精作为牙签粘取花粉块的浸润助剂，下面花序用清水作助剂，进行异花授粉对比试验;相应变换助剂种类与花序位置，同法对另1盆开展试验。重复2次。

1．4 授粉操作 2015年5～6月在铁皮石斛栽培基地内，选择茎干粗壮、生长繁盛、无病虫害的植株进行人工授粉。先用镊子掰掉父本花朵的唇瓣，小心掀开药帽，用牙签浸润助剂后将花粉粒粘起，送往已去掉唇瓣的母本花朵的柱头窝内。授粉过程中要小心操作，不能损伤柱头窝，花粉块粘附在母本的柱头窝内授粉才完成;经常更换牙签，保持传粉器具的洁净，避免杂物污染和花粉干扰。

1．5 调查统计 授粉后及时挂牌做标记。授粉30 d后调查每处理的结实数量，计算座果率，运用Excel 2003进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2．1 授粉方式与座果率 铁皮石斛为总状花序，属节生或顶生花序类型。花序一般多着生于多年生枝条的中上部，位置与叶腋相对，每序通常具花3～5朵。经长期进化，铁皮石斛花器与传粉形成系列独特的适应机制。如花朵授粉成功，第2天花萼、花瓣明显收缩直至纵向收拢闭合，3 d后花朵基部开始加粗，5 d后花冠干缩萎蔫，花梗顶端颜色变深、增粗现象更加明显，10 d后幼果初具雏形;如花朵授粉失败，第2天花冠也明显收缩，3 d后花梗颜色开始变黄，5 d左右即行脱落。撕揭、损伤唇瓣或药帽而未经授粉的花朵，则花期如常，无上述明显变化。

表1显示，授粉方式对铁皮石斛座果率影响很大，其中以异花授粉的座果率最高，平均达90．51%，而其他自花授粉方式(同花、同序、同枝)均比较低，一般不超过40%，平均为5．55%，可见铁皮石斛以异花授粉为主;自花授粉座果率因个体而异，变幅较大(0～36．84%)，说明部分植株可自花结实;同丛授粉座果率变幅较大，主要源于丛内个体亲疏构成不同，无亲缘关系的丛生植株间相互授粉座果率高，但因丛内多属萌孽，故平均座果率仅17．22%;调查表明，野外条件下铁皮石斛依靠昆虫辅助授粉能受精结实，但结实率通常较低，一般低于4%，平均为1．82%，其中以郁闭林分内杜英树上附生的植株为高，结实率达2．84%。从铁皮石斛在不同栽培条件下各种授粉方式平均座果率的综合比较(图1)可看出，异花授粉座果率显著高于其他授粉方式。异花授粉应是铁皮石斛的主要繁殖方式，也是生产繁育的主要手段。

表1 不同授粉方式对铁皮石斛座果率的影响

2．2 花序贮藏与座果率 4℃冷藏铁皮石斛花序，每天授粉连续9 d，以受精结实情况反映冷藏花粉的活力变化，并以相同花期的自然花序作对照。结果表明(表2)，试验期内不同贮藏时间的冷藏花粉仍具有较高活性，座果率均保持在89%以上，平均座果率达94．22%，座果率日变化比较平稳，花粉活性随冷藏时间无明显变化趋势，可见短期冷藏花序不会影响授粉效果。经t检验，冷藏花序与自然花序(对照)的座果率间无显著差异(t=-0．534 9 ＜ t0．05=2．160 4)，说明铁皮石斛花序离体冷藏与活体留枝保存均能较长时间保持花粉活力，花粉可授性时间较长。

表2 不同贮藏时间的铁皮石斛冷藏花序授粉效果

2．3 粘附助剂与座果率 铁皮石斛人工辅助授粉时，通过助剂润湿传粉器具后，能使传粉器具轻易粘附花粉块进行授粉操作，牙签相较镊子等器具更为方便、灵活，可大大提高工作效率。表3显示，使用75%酒精或清水作授粉时的粘附助剂，平均座果率高达91．29%，经双因素方差分析，助剂种类(F=0．404 2)和花序节位(F=0．439 2)间均不存在显著差异(F0．05=7．708 6)。作为普通溶剂，酒精与清水非常容易制取，作为粘附助剂均能保证授粉效果，可在生产实践中任选使用。

表3 不同粘附助剂的授粉效果

3 结论与讨论

(1)据报道，多数兰科植物自交亲和，但石斛属大部分种类自交不亲和［6］。该研究表明铁皮石斛异花授粉平均座果率高达90．51%，而自花授粉平均为5．55%，可见铁皮石斛属部分自交亲和，而异花授粉是其主要繁殖方式。自交结实情况因个体而异差别较大，变幅为0～36．84%，经测算能自交结实的株丛约占3成;野外条件下铁皮石斛存在自然结实现象，但结实率通常低于4%。铁皮石斛这种异花授粉为主且部分自交亲和、能自然结实的授粉结实特性，对于岛状零星分布的濒危资源保护、种群繁衍及制定育种策略具有重要的理论价值和现实意义。

(2)铁皮石斛花粉活力持续时间较长，几乎整个花期人工授粉结实率均可达85%以上，有效保存花粉对解决花期不遇或开展异地杂交具有重要意义。铁皮石斛花序4℃离体冷藏，冷藏后9 d内，其花粉授粉的座果率均在89%以上，平均为94．22%，花粉活力远高于相同贮藏时限、不同条件下的干燥花粉［7］，花序冷藏不失为一种简便实用的短期保存花粉的有效方法。成熟度较高花蕾中花粉也具授粉活性，其淡白色的花粉块也能使雌蕊受精结实，初步试验结实率＞80%，但花蕾冷藏后停止发育，花瓣不再开放，不利授粉操作，故冷藏花序以采集刚开放的新鲜花序为宜。

(3)兰科植物花粉外面包裹类脂膜，使得兰花花粉粒黏连成花粉块［8］。但这层类脂膜粘性不强又不保湿，花粉块暴露空气中很容易失水干缩失去粘性。如用酒精或清水作粘附助剂，润湿授粉器具后很容易从药帽中粘附花粉，且不影响花粉活性，平均座果率可达90%以上。实践操作中任选一种作助剂，能使授粉操作更为便捷，可大大提高授粉效率。花粉块在空气中暴露时间不宜过长，授粉时最好从花朵药帽中直接粘取，随取随授。

(4)铁皮石斛花量大、可授期长，通过人工授粉容易制取大量果实。铁皮石斛幼果在生长发育过程中，存在落果、败育和昆虫为害、取食现象。不同授粉方式对铁皮石斛种子活力的影响程度、落果原因等尚不明确，需要进一步研究。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:一部［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:265．

［2］陈晓梅，李媛媛，郭顺星．石斛属植物种子萌发的研究进展［J］．中国药学杂志，2013，48(19):1629 －1633．

［3］国家环境保护局，中国科学院植物研究所．中国珍稀濒危保护植物名录［M］．北京:科学出版社，1987．

［4］斯金平，诸燕，朱玉球．铁皮石斛人工栽培技术研究与应用进展［J］．浙江林业科技，2009，29(6):66 －70．

［5］倪勤武，来平凡．浙江富阳发现野生铁皮石斛新分布［J］．林业科学研究，2000，13(2):222．

［6］王晓静，余乐，殷寿华．授粉方式对流苏石斛结实率及种子活力的影响［J］．云南大学学报(自然科学版)，2009，31(S1):374－377．

［7］朱波，苑鹤，俞巧仙，等．铁皮石斛花粉活力与种质创制研究［J］．中国中药杂志，2011，36(6):755 －757．

［8］郑宝强，王雁，彭镇华，等．卡特兰花粉萌发和花粉贮藏性研究［C］//张启翔．中国观赏园艺研究进展．北京:中国林业出版社，2013:188－192．