郑琳，高世伟

(湖北省农业科学院果树茶叶研究所，湖北武汉430064)

茶多酚是一类存在于茶树中的多羟基酚类化合物，具有抗氧化、抗突变、抗癌变［1］、抗衰老等功效，常被用作天然无毒的食品添加剂［2］，安全性好。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为茶多酚的一种主要单体成分，具有防突变、抗癌、抗病毒、抗氧化、抑制生物膜、神经保护、调节代谢、抑菌消炎等功能特性［3］。目前，茶多酚和EGCG都被广泛应用于食品、保健品、医药、日化等领域。

“道泉雅女茶”产自四川省唯一一个国家级生态建设先进县——洪雅，茶区山青水碧、峡幽林茂、雅自天成，平均森林覆盖率达62．7%，空气中负氧离子的含量更是高达18 000个/cm3，享有“绿海明珠”的美誉。茶叶在呼吸之间纳取空气中的“长寿因子”，积淀为翠润的色泽和幽雅的香气。

笔者以道泉雅女茶为原料，研究浸提条件对茶多酚和EGCG浸出量的影响，拟为道泉雅女茶下盘茶的利用提供依据，同时为茶多酚等茶叶深加工产品的生产提供研究基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 茶叶原料。四川尚林生物资源开发有限公司“道泉雅女茶”下盘茶。

1．1．2 主要试剂。硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙醇、柠檬酸、异位酸钠(VC-Na)，均为分析纯;冰醋酸、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇，均为色谱纯;水为重蒸馏水。

1．2 方法

1．2．1 茶多酚的提取。称取2．0 g茶粉，置于100 ml的锥形瓶中，加入40 ml温水，80℃水浴80 min，浸提液趁热过滤并洗涤茶渣数次，滤液冷却后定容至250 ml，摇匀后得供试样品。

1．2．2 浸提溶剂的选择试验。同等环境条件下称取“道泉雅女茶”下盘茶5份，每份20 g，分别加入热水、乙醇、柠檬酸和VC-Na，各成分比例见表1。

浸提温度80℃，浸提时间80 min，获得浸提液后，研究浸提溶剂对浸提液中茶多酚含量的影响。由于VC-Na对树脂的影响，故选取柠檬酸、乙醇及水浸提得到的浸提液分别装聚酰胺树脂做柱色谱分离试验，浸提液温度降为30～40℃后，上柱吸附1 h，先后用500 ml 25%乙醇和520 ml 80%乙醇洗脱，收集变色(清亮的黄色变成酒红色)0．5 min以后的洗脱液，做HPLC分析，研究浸提溶剂对成品中EGCG含量的影响。

1．2．3 浸提温度、时间、料液比的单因素试验。按照茶多酚提取方法，温度条件依次为 40、50、60、70、80、90 ℃，浸提时间依次为 40、50、60、70、80、90 min，料液比依次为 1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶25 g/ml，以此研究各因素的影响作用。

1．2．4 正交试验。通过单因素试验，分析各因素对有效成分得率的影响，确定较佳的单因素试验条件范围，在此基础上，以浸提温度、浸提时间、料液比为主要影响因素，各选出3个水平，安排L9(33)正交试验分析(表2)。

表2 正交试验L 9(33)因素和水平

1．2．5 浸提液中茶多酚含量的测定。参照GB/T8313－2002(酒石酸亚铁比色法)，用紫外分光光度计测定浸提液中茶多酚的总量。

1．2．6 浸提液中EGCG含量的测定。取一定量茶多酚供试液，过0．22μm微孔滤膜，HPLC分析。HPLC测定条件:色谱柱选用 LunaC18柱(4．6 mm ×150 mm，5 μm)，L-2420 型 UV紫外检测器，流动相A为N，N-二甲基甲酰胺∶甲醇∶冰醋酸=40∶2∶1．5 ，流动相 B 为重蒸馏水，流速1 ml/min，柱温40℃，检测波长278 nm，采用线性梯度洗脱，梯度见表3。儿茶素组分标准样液相色谱图见图1。

表3 线性梯度洗脱

2 结果与分析

2．1 浸提溶剂的选择试验结果 图2显示了浸提液中茶多酚含量与浸提溶剂的关系，由此可知，添加有柠檬酸和VCNa的浸提液对茶多酚的浸提效果最好，然后依次为添加柠檬酸的浸提液、乙醇浸提液、添加VC-Na的浸提液、水。

表4显示了不同浸提溶剂同等环境下得到的儿茶素成品HPLC分析结果。由表4可知，水作为浸提溶剂，经柱色谱分离得到的儿茶素成品咖啡因含量较低，总儿茶素含量较高。分析其原因为:添加柠檬酸的浸提液pH较低，不利于儿茶素成分的吸附和洗脱;乙醇在浸提过程和柱层析过程中不能够很有效地控制其挥发，同时严重影响了EGC对聚酰胺树脂的有效吸附。综合考虑溶剂的溶解选择性、容易回收性、适当的密度、表面张力、安全性、化学稳定性和生产成本等因素，以及HPLC分析结果，选择最佳浸提溶剂为水。

表4 儿茶素成品的HPLC分析

2．2 浸提温度对浸提液中茶多酚和EGCG含量的影响 图3表明，在一定温度范围内，随着温度的升高，浸提液中茶多酚的含量随之升高，当温度超过80℃，茶多酚含量随温度升高而下降，而且90℃温度下浸提出的茶汤颜色偏黑。

图4表明，在一定温度范围内，随着温度的升高，浸提液中EGCG的含量随之升高，当温度为80℃时，EGCG含量达到最大为6．0427%，温度接着升高，EGCG的含量反而下降。

综合考量浸提液中茶多酚和EGCG含量与温度的关系，分析其原因为:浸提以扩散原理为基础，随温度升高，扩散速度加快，浸提液中茶多酚和EGCG含量均有所增加，但当温度到达一定值后，茶多酚和EGCG的氧化速度也加快，含量反而有所下降。

2．3 浸提时间对浸提液中茶多酚和EGCG含量的影响 图5表明，在一定温度范围内，浸提液中茶多酚的含量与浸提时间成正比关系，浸提时间越长，茶多酚含量越高，当浸提时间为80 min时，茶多酚含量达到最大，超过这个点，时间延长茶多酚含量反而降低。

图6表明，在一定温度范围内，浸提液中EGCG含量与时间成正比关系，时间越长，EGCG含量越高，当浸提时间超过60 min，含量明显提高，当浸提时间为80 min时，EGCG含量为最大，超过这个点，时间延长浸提液中EGCG含量反而降低。

综合考量浸提液中茶多酚和EGCG含量与浸提时间的关系，分析其原因为固－液浸提过程为3步:①溶剂进入固体内部，溶质溶解。②溶质从固体内部到表面。③溶质溶解液从固体表面到溶剂中。这个过程需要一定的时间，在这个时间范围内，随浸提时间的延长，茶多酚和EGCG浸出量增加，但当浸提时间到达一定值后，茶多酚和EGCG因温度原因加快其氧化速度，含量反而有所下降。

2．4 料液比对浸提液中茶多酚和EGCG含量的影响 图7表明，随着浸提用水量的增加，浸提液中茶多酚含量呈上升趋势，当料液比达到1∶20 g/ml时，再增加浸提溶剂的量对茶多酚的浸出影响不大。

图8表明，随着浸提用水量的增加，浸提液中EGCG含量基本呈上升趋势，当料液比达到1∶20 g/ml时，再增加浸提溶剂对EGCG的浸出影响不大，甚至有略微下降趋势。综合考量浸提液中茶多酚和EGCG含量与料液比的关系，分析其原因为:茶粉中所含的水溶性有效成分是一定的，随着浸提用水量的增加，茶多酚和EGCG的浸出含量基本呈上升趋势，当浸提用水量到达一定值后，茶粉中水溶性成分已全部浸提出，再增加用水量也没有明显增加，反而会因温度等原因加快茶多酚和EGCG的氧化，同时给后续吸附、洗脱和浓缩处理增加能耗，提高生产成本。

2．5 正交试验确定浸提茶多酚和EGCG的最佳条件 由直观分析表5可以看出，3个因素对浸提液中茶多酚含量的影响的主次关系依次为:浸提温度、浸提时间、料液比;对浸提液中EGCG含量的影响的主次关系同样依次为:浸提温度、浸提时间、料液比。方差分析显示，各因素对浸提液中茶多酚含量的影响，FA=469．824＊＊，FB=17．382，FC=5．353，F0．05=19．00，F0．01=99．00;各因素对浸提液中 EGCG 含量的影响，FA=1 251．500＊＊，FB=194．000＊＊，FC=5．500，F0．05=19．00，F0．01=99．00。由此可以看出，浸提时间对浸提液中茶多酚含量的影响不显著，但对浸提液中EGCG含量的影响极为显著;料液比对浸提液中茶多酚和EGCG含量的影响都不显著。

由直观分析表5可见，于茶多酚的浸提效果而言，最佳工艺组合为A2B2C2，于EGCG的浸提效果而言，最佳工艺组合为 A2B2C1，但料液比1∶18 g/ml和 1∶20 g/ml对浸提液中EGCG含量的影响差别极小，料液比的影响本身又不显著，故选择浸提的最佳工艺组合为A2B2C2即浸提温度80℃，浸提时间80 min，料液比1∶20 g/ml，经验证试验，该最优条件下，浸提液中茶多酚含量为20．16%，EGCG含量为6．108%。

表5 正交试验L 9(33)结果

3 结论与讨论

在单因素试验的基础上，采用L9(33)正交试验确定道泉雅女茶中茶多酚和EGCG的最佳浸提工艺参数为:浸提温度80℃，浸提时间80 min，料液比1∶20 g/ml。此工艺条件下，以水为浸提溶剂，得到的浸提液中茶多酚含量为20．16%，EGCG含量为6．108%。该方法绿色无污染，对提高道泉雅女茶下盘茶的利用率具有重要意义，同时为工业化制取茶多酚、分离纯化EGCG单体提供研究基础。

［1］YANGCS，LI G X，YANG Z H，et al．Cancer prevention bytocopherols and tea polyphenols［J］．Cancer letters，2013，334(1):79 －85．

［2］蒋丽，王雪梅，全学军，等．不同提取方法对茶多酚理化性质的影响［J］．食品科学，2010，31(14):136 －139．

［3］SINGH B N，SHANKAR S，SRIVASTAVA R K．Green-tea-catechin，epigallocatechin-3-gallate(EGCG):Mechanisms，perspectivesand clinical applications［J］．Biochem pharmacol，2011，82:1807－1821．