李晓筠，史黎黎，李根福，陈兆明，孙成波，2*

(1．广东海洋大学水产学院，广东湛江524088;

2．广东高校热带海产无脊椎动物养殖工程技术研究中心，广东湛江524025)

我国对虾产业自20世纪80年代开始快速发展，与此同时养殖环境受到不同程度污染，各类病害更是层出不穷。白斑综合症(White spot syndrome，WSS)和桃拉综合症(Taura syndrome，TS)是对虾养殖业危害最为严重的病毒性疾病，均具有传播快、死亡率高的特点。白斑综合症病毒(White spot syndromevirus，WSSV)，隶属线性病毒科 (Nimaviridae)、白斑综合症白斑病毒属(Whispovirus)，最早发生于20世纪90年代初期台湾的对虾养殖地区［1］，随后迅速蔓延至世界各养殖区域，给对虾养殖业造成重创［2－3］。WSSV宿主广泛，致死率高，可使发病对虾3～10 d死亡率可达100%［4］。桃拉综合症病毒(Taura syndrome virus，TSV)，隶属双顺反子病毒科(Dicistroviridae)、蜜蜂麻痹病毒属(Aparavirus)，最早在厄瓜多尔地区出现，可导致仔虾、稚虾和幼虾的累计死亡率高达40% ～90%［5］，给对虾的生产带来严重威胁。国际兽疫局(OIE)将二者列为需要报告的水生动物病毒性疫病［6］。

斑节对虾在我国东南沿海地区有较长的养殖历史，有良好的养殖基础，但长期受到病害的困扰，危害较为严重的主要是病毒病。病毒病的暴发不是单纯病毒的作用，而是虾、环境以及病毒相互作用的结果。温度、盐度、pH、氨氮含量等环境因素变化往往使对虾产生应激反应、抵抗力下降，诱使潜伏感染的对虾发病［7－8］。其中，盐度直接影响斑节对虾的蜕壳、成活和生长等生理活动，是斑节对虾的生长环境中较为重要的影响因子［9－10］。为了检测斑节对虾幼虾在不同盐度下对WSSV和TSV敏感性差异，探索在实际生产过程中如何有效地控制环境因子，笔者采用投喂感染的方法使斑节对虾幼虾人工感染WSSV和TSV，研究不同盐度对斑节对虾的抗病力的影响，提高斑节对虾抗病毒力，达到对虾养殖高产、稳产的目的。

1 材料与方法

1．1 材料 试验在广东海洋大学南三海水试验基地进行，试验所用斑节对虾幼虾来自湛江市浩海虾苗场，于基地培育暂养10 d。试验器材有150 L白色塑料桶、16 L塑料桶、空气压缩机、JA5003型电子天平(精确到0．001 g)、直尺。投喂人工配合饲料。病原为惠州爱试灵生物科技有限公司病虾，经PCR检测结果均为阳性。试验用水为海区抽取经沙滤、沉淀，再用有效氯浓度为20 g/m3的强氯精充气暴晒处理，确保水体无病源生物。

1．2 方法

1．2．1 试验设计。试验盐度梯度设置为5、10、15、20、25、30、35 和40，分别标记为 A、B、C、D、E、F、G、H 共 8 个组，每个盐度梯度设3个平行组，每个平行放幼虾100尾，饲养于150 L的白色塑料桶中，养殖水体为120 L。投喂人工配合饲料，1.5 h后吸污换水，换水量约为水体体积的30%，暂养时间10 d。从对应的平行中取大小均匀的虾30尾放于16 L的养殖桶，分别作为对照组、WSSV攻毒组和TSV攻毒组，每组设置3个平行。攻毒前，虾饥饿空胃24 h。试验组投喂的饲料中混有携带相应病毒的对虾碎屑，对照组按试验前投喂，试验期10 d。

1．2．2 存活率统计。攻毒组每天统计各平行的死亡数和试验后的存活率。

1．2．3 病毒检测。采用半定量IQ2000TMPCR检测WSSV和TSV［11－12］，检测方法参照试剂盒说明书进行。

试剂配制:第1次扩增反应(First PCR):8μl/reaction、First PCR PreMix 7．5 μl、IQzyme DNA Polymerase 2 U/μl 0．5 μl;第2 次扩增反应(Nested PCR):15 μl、Nested PCR Polymerase 2 U/μl。

反应条件:第1次扩增反应(First PCR):94℃ 2 min;然后再运行94℃ 20 s;72℃ 30 s，15个循环;最后72℃，再延伸30 s，20℃30 s。第2次扩增反应(Nested PCR):94℃ 20 s;62℃ 20 s;72℃30 s，30个循环;最后再延伸72℃ 30 s，20℃30 s。通过琼脂凝胶电泳检测PCR产物，通过紫外凝胶成像系统拍照，判断结果后保存。

1．2．4 数据统计与分析。数据分析采用单因素方差分析(ANOVA)和样本均值多重分析方法进行统计，并对试验数据进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2．1 不同盐度下斑节对虾对WSSV的敏感性 从图1～2可以看出，感染后第3天开始出现死亡，死亡率随着时间的推移而上升，到第8天基本趋于稳定。当盐度为25时的存活率最高(41．11%)，达到极显著水平(P＜0．01);当盐度为20和30时存活率差异不明显。各组存活率依次为:盐度20(33.33%)＞盐度30(28．89%)＞盐度15(17．78%)＞盐度35(14．44%)＞盐度40(6．67%);当盐度为5和10时，存活率均为0。

2．2 不同盐度下斑节对虾对TSV的敏感性 从图3～4可以看出不同盐度下斑节对虾幼体的存活率都很高，其中盐度25时斑节对虾幼体的存活率最高，为64．44%(P＜0．01)，盐度为5、10、35及40的试验组之间差异不显著。各试验组斑节对虾幼体的存活率依次为:盐度20(53．33%)＞盐度15(47.78%)＞盐度30(44．44%)＞盐度40(35．56%)＞盐度35(35．56%)＞盐度10(34．44%)＞盐度5(30%)，没有出现死亡率100%。

2．3 PCR病毒检测结果 攻毒试验前随机抽取30尾幼虾作为初始样本，通过半定量PCR检测是否携带WSSV和TSV，结果全部为阴性(阴性率100%)。试验后WSSV和TSV组中死虾和存活虾经检测全部为阳性，阳性率为100%。投喂的病虾经PCR检测全部为WSSV阳性和TSV阳性(图5)。

3 讨论

从20世纪90年代开始，对虾的养殖区域暴发过多次病毒性疫病，环境受到污染。养殖区域存在大量的难以清除的病原体，对虾被病毒感染的比率很高。从感染到发病有一定的潜伏期，处于感染潜伏期的对虾在安全的环境中仍可正生长。近年来很多研究发现引起WSS暴发的原因不仅与虾体的免疫水平、病毒数量、感染方式有关，还与环境因子密切相关［13］。何建国等［14］认为WSSV的潜伏期感染具有很大的危害性，一旦气候和水环境因子发生变化极容易导致潜伏期感染转为急性感染。

在对虾的生长环境中，盐度是重要的环境因子之一，它直接作用于对虾渗透调节、代谢酶活性和免疫等功能，影响了对虾的存活、生长。研究表明，盐度改变会引起对虾体内相关免疫指标变化［15］。叶建生等［16］报道指出盐度突变在短时间内引起血液渗透压变化如对虾体内的超氧阴离子产量随着盐度突变值增加而增加，血清中酚氧化酶活性随着盐度突变值增加活性升高越快，血清中SOD活性随着盐度突变值增加而降低，血清蛋白含量随着降低特别是盐度降低能引起对虾血细胞数量明显降低，导致酚氧化酶活性升高。许多甲壳动物都具有一定程度的广盐适应性［17－18］，最佳生长、存活和生产效率的盐度水平常常因种类而异［19－23］。斑节对虾幼虾对低盐度的适应能力较强。缓慢降低盐度至1‰，斑节对虾幼虾没有死亡;在纯淡水中可存活5 d左右。当水体盐度从25突然降至10时，斑节对虾成活率为93．3%;当水体盐度突然下降至2时，斑节对虾成活率只有43．3%，可见盐度突变对斑节对虾成活率有很大影响。一般认为，25左右的盐度是斑节对虾养殖最理想的盐度［9］，在生长效率最佳的盐度条件下斑节对虾的免疫能力也是最强的［24］。该试验结果基本与上述观点符合，盐度为25时斑节对虾对WSSV与TSV的存活率最高。当盐度为5时斑节对虾对WSSV和TSV的存活率最低，各组间差异不明显。在合适的盐度条件下，虾的免疫功能没有受到损害，对病害有较强抵抗能力。

该试验采用投喂的方式进行攻毒，感染斑节幼虾。WSSV攻毒的最有效方法是投喂法和注射法［25－26］，但是人工注射方法对虾体的物理伤害作用较大，幼虾不宜采用。感染3 d后，斑节对虾的头胸甲上出现白斑，行动迟缓所表现的发病过程符合WSSV的发病特征。PCR检测结果表明斑节对虾全部感染WSSV。不同盐度组下斑节对虾对WSSV的存活率也表现出显著差异。这可能是因为不同的盐度影响了斑节对虾幼体的抗病力，进而造成虾体对病害的免疫力不同。斑节对虾幼体从第3天开始出现死亡，第8天基本趋于稳定，死亡速度极快，且大量死亡，说明斑节对虾幼体对WSSV的敏感性很强。

TSV同样通过人工感染的方法感染斑节对虾。研究发现，通过人工感染中国对虾、日本对虾、斑节对虾以及桃红对虾均能发病。但是，在自然状态下尚未见到对这几种虾类被TSV感染导致较大损失的报道［27］。在实验室条件下，注射感染TSV的病虾的组织匀浆和投喂感染TSV的病虾均可引起发病［28］。不同盐度下斑节对虾对TSV的存活率差异不显著。在实际养殖过程中，感染TSV后，若能及时控制好环境，改良底质、改善水质、增加溶氧等，可以控制病情，依然获得很好的收成。试验过程中，放养密度小、连续充氧、水质良好。试验中虾体都携带TSV，但其死亡率很低，可能与试验中的环境条件有关。通常感染后的对虾在环境恶化时，其死亡速度更快，死亡量也加剧。也有部分经过发炎、再生或修复过程可转危为安，修复期虾对TSV的再感染具有抵抗力，感染后的幸存者一旦表皮脱落，甲壳角质层出现黑斑化现象，变成无症状的TSV携带者［24］。这些是对虾被感染后可存活的原因。

综上所述，盐度变化会提高斑节对虾幼虾对WSSV的易感性，而其对TSV的易感性则低于WSSV。盐度是引起白斑综合症暴发的关键影响因子，在对虾养殖过程中必须谨慎控制。

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