路则宝

(楚雄医药高等专科学校，云南楚雄675005)

内生菌可生活在各种植物的根、叶、茎、花与果实内，主要包括细菌、真菌、放线菌，其类群十分丰富，能够产生很多新的活性物质，因此植物内生菌已成为国内外生物学和化学领域的研究热点。内生菌对于宿主植物主要有益的作用有调节生长、抗虫害、抗逆性及促进植物体内次生代谢产物的合成等。内生菌可以通过促进中药有效成分的生成或积累影响道地药材的形成与品质。随着植物内生菌研究的不断深入发展，多种有药用价值的菌株、代谢产物不断被发现。Rubalcava等［1］从马鞭草(Callicarpa acuminata)内生真菌Edenia gomezpompae中分离到具有化感素活性及抗真菌活性的萘醌(spiroketal)物质。Rukachaisirikul等［2］报道，一种具有抗结核和抗真菌的活性化合物phomoenamide是由内生真菌Phomopsis sp所产生的。因此，植物内生菌在农业、工业、医药卫生等领域有巨大的应用潜力。

药用植物作为一类新的内生菌来源正成为内生菌研究者广泛研究的对象。药用植物内生真菌的研究对于开发利用药用植物及药用植物资源的保护有着非常重要的经济效益和生态效益。青阳参(Cynanchum otophyllum Schneid)是萝摩科鹅绒藤属(Cynanchum Linn．)植物，属多年生草本缠绕植物，根茎入药，一直在云南民间流传沿用，主产于云南中部、西北部和东北部地区。以青阳参为原料，现已开发出云南特色多种中成药。有许多学者已对青阳参的化学成分，药理毒理活性、含量测定，生药学，繁殖技术和遗传多样性等进行了深入研究［2－5］。但是，对于青阳参植物内生菌的研究报道至今未见。笔者就青阳参植物内生菌进行分离和分类鉴定，以期为青阳参资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1供试植物样品 植物样品青阳参采自云南省楚雄市西山，海拔高度1 800 m。

1．2 培养基 细菌的分离培养用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 5 g、琼脂 20 g，水 1 000 ml，pH自然，加入两性霉素B以抑制真菌生长)。

真菌分离培养用PDA固体培养基(加入青霉素、链霉素以抑制细菌生长)，真菌鉴定用PDA固体培养基、促孢固体培养基(KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0．5 g、KNO31 g、KCl 0．5 g、淀粉 0．2 g、蔗糖 0．2 g、葡萄糖 0．2 g、琼脂 20 g，蒸馏水1 000 ml，pH 自然)。

1．3 内生菌的分离、纯化和培养 采集健康、新鲜的叶、茎和根组织样品，冲洗干净，并且吹干表面水分。取适量无菌水、75%乙醇、0．1%升汞，分别放入预先灭菌的烧杯中，将植物叶、茎和根剪成长段，备用。样品先于75%乙醇中浸泡消毒，然后于0．1%升汞中浸泡消毒，将消毒完毕的样品在无菌水中连续清洗后晾干，剪成小块，用无菌的解剖刀从中间切开，使得植物内部尽量暴露。将剪好的小块分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基和PDA固体培养基平皿表面，同时用清洗消毒样品的无菌水涂布为对照，分别于37和28℃培养，挑取植物组织周围的菌落，对所分离的内生菌进行纯化，并且根据菌落形态特征和个体形态特征进行归类培养［6］。

1．4 内生菌的分类鉴定 内生细菌的鉴定参照文献［7－8］，同时依据菌落形态观察、革兰氏染色形态、荚膜和芽孢有无、动力学试验、生理生化特征等进行研究。

真菌鉴定采用平板插片法，将菌种接种于固体PDA和促孢固体培养基上，28℃培养，菌落长出时斜插灭菌盖玻片，培养后用镊子取下盖玻片在光学显微镜下观察显微形态特征，鉴定到属(分类检索参照文献［9－11］)。

2 结果与分析

2．1 不同部位分离出内生菌的数量分布 内生菌在不同组织中种群、数量分布有差异，共分离出内生菌56株，真菌34株，细菌22株;根中分离28株，茎中9株，叶中19株。在根、茎、叶中分别分离出细菌12、3、7株，分别分离出真菌18、4、12株。总的内生菌分离结果为根部最多，茎中最少。

有些种属在各个组织中均有分布，有些则表现出一定的组织专一性。叶中优势细菌种群为芽孢杆菌属和泛菌属，根中为土壤杆菌属、假单胞杆菌属和肠杆菌属。叶中优势真菌种群为交链孢属，根中优势种群为腐霉属。

2．2 内生菌种群组成多样性 通过菌落形态、染色镜检等，初步鉴定22株内生细菌属于6个属，包括土壤杆菌属(Agrobacterium sp．)、芽孢杆菌属(Bacillus sp．)、泛菌属(Pantoea sp．)、肠杆菌属(Enterobacter sp．)、黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)，表明青阳参内生细菌具有生物多样性。

从植物根、茎和叶中，共分离获得34株内生真菌，其中25株内生真菌经形态学显微观察鉴定为12属(表1)，说明青阳参植物内生真菌种类繁多，微生物资源丰富。在科一级分类水平上，以丛梗孢科和暗梗孢科为优势类群;在属的分类等级上，优势最明显的是交链孢属(Alternaria Nees)，共有6株，占总菌株17．6%，其次是腐霉属(Pythium)，共有5株，占菌株总数的14．7%。

表1 青阳参植物内生菌种群组成

3 结论

通过对青阳参植物内生菌的分离、鉴定，发现其内生菌种类多、数量大，微生物资源丰富。该研究不仅为发现新种，而且为筛选出具有生物活性天然产物的内生菌提供了丰富的资源。在青阳参植物不同的组织中内生菌有不同的分布，表现出一定的组织专一性。这可能与不同组织的生理结构和活性物质有关。鉴于内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似活性代谢产物，该研究将有利于促进植物内生真菌资源的研究与应用。随着野生青阳参植物的日益减少，从内生真菌出发，研究内生真菌与其的相互关系，筛选能够产生与宿主类似活性化合物的菌株，将具有重要的研究意义和应用意义。总之，随着我国的传统野生药用植物资源的日渐枯竭，通过对药用植物内生菌的分类学、生态学、代谢产物化学等进行系统的研究，将会极大地促进药用植物资源的开发和利用。

研究中存在的问题主要在于该次试验用的标本植株量较少，也未对不同区域、不同季节植株进行比较。内生菌的鉴定还需要采用分子生物学手段如16SrRNA、18SrRNA和ITS序列分析等进一步鉴定。这些工作还有待进一步研究。随着研究范围的扩大和研究的深入，更多的青阳参植物内生菌将会被发现、应用。

［1］RUBALCAVA M L M，BAUTISTA B E H，ESTRADA M J，et al．Naphthoquinone spiroketal with allelochemical activity from the newly discovered endophytic fungus Edenia gomezpompae［J］．Phytochemistry，2008，69:1185－1196．

［2］RUKACHAISIRIKUL V，SOMMART U，PHONGPAICHIT S，et al．Metabolites from the endophytic fungus Phomopsis sp．PSU-D15［J］．Phytochemistry，2008，69:783 －787．

［3］黎丽云，殷志琦，张庆文，等．云南民间药青阳参的研究进展［J］．海峡药学，2011，23(4):1 －5．

［4］王斌，王德斌，翟书华，等．云南青阳参遗传多样性的AFLP研究［J］．中草药，2011，42(5):985 －989．

［5］杨竹雅，普春霞，钱子刚．青阳参及其近缘种的RAPD研究［J］．中国现代应用药学杂志，2009，26(7):562 －566．

［6］杨清香，谢永生，张昊，等．怀地黄活性内生菌的分离鉴定及抗菌抗肿瘤活性［J］．微生物学通报，2010，37(10):1467 －1474．

［7］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［M］．北京:科学出版社，2001．

［8］布坎南R E，吉本斯N E．伯杰细菌鉴定手册［M］．中国科学院微生物研究所翻译组，译．8版．北京:科学出版社，1984．

［9］魏景超．真菌鉴定手册［M］．上海:上海科学技术出版社，1982．

［10］戴芳澜．真菌的形态和分类［M］．北京:科学出版社，1987．

［11］邵力平，沈瑞祥，张素轩．真菌分类学［M］．北京:中国林业出版社，1984．