宁 天，黄维真，李军芳，张 清，梁 红，乐 宁，赵小杰，宁小清

(1. 广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023；2. 广西壮族自治区妇幼保健院/广西妇产医院，广西 南宁 530003；3. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001)

壮药白花九里明提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抗菌作用研究

宁 天1，黄维真2，李军芳3，张 清2，梁 红1，乐 宁3，赵小杰3，宁小清3

(1. 广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023；2. 广西壮族自治区妇幼保健院/广西妇产医院，广西 南宁 530003；3. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001)

目的 研究壮药白花九里明水、醇提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)体外抗菌的作用，为临床治疗MRSA感染提供新的途径。方法 制备壮药白花九里明水、醇提取物，采用纸片扩散法对临床分离的MRSA菌株进行体外抑菌实验，肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果 壮药白花九里明的水提取物抑菌圈直径为18～24 mm，醇提取物抑菌圈直径为11～18 mm；水提取物的MIC为31.25～250 mg/mL、MBC为31.25～250 mg/mL，醇提取物的MIC为31.25～250 mg/mL、MBC为62.5～500 mg/mL。结论 壮药白花九里明水、醇提取物对MRSA菌株有较好的抑制作用。

白花九里明；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度；体外抗菌

随着抗菌药物的广泛应用和滥用，很多细菌产生了耐药性，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染问题日益严重，单纯使用抗生素已经不能满足临床的需要。从纯天然民族药中寻找抗菌成分为新抗菌药研发提供了新的途径，其来源广、价格低廉且不良反应少的特点也显示了具有进一步开发的优势，因此，从纯天然民族药物中找寻抗微生物感染的新药越来越受到关注[1-4]。壮药白花九里明来源于菊科艾纳香属植物东风草[Blumea megacephala (Randeria) Chang et Tseng]干燥全草，本研究观察了壮药白花九里明水、醇提物对MRSA的体外抗菌作用，为进一步对壮药白花九里明的新药开发及临床应用和相关研究提供科学依据。

1 实验资料

1.1材料

1.1.1实验菌 MRSA来自广西妇幼保健院、广西民族医院微生物室2012年11月—2013年10月临床分离鉴定菌株，根据菌株保存时间按随机数字法抽取8株MRSA为实验菌。

1.1.2试剂 Mueller-Hinton 肉汤培养基(MHB)、Mueller-Hinton琼脂培养基(MH)，均为杭州天和生物技术有限责任公司生产。抗生素药敏纸片，英国奥赛公司生产。

1.1.3植物原材料 壮药白花九里明采自广西南宁市郊区，经广西中医药大学宁小清高级实验师鉴定为菊科植物东风草Blumea megacephala(Randeria) Chang et Tseng的地上部分。

1.1.4壮药白花九里明水提取液的制备 取阴干药材剪碎，加水过面浸泡30 min后，煎煮3次，每次1 h，过滤后合并3次滤液，浓缩至水煎液浓度为3 g/mL，取3 g/mL水提取液20 mL稀释为1 g/mL，备用。

1.1.5壮药白花九里明醇提取液的制备 取阴干药材剪碎，加80%乙醇回流提取，反复2次，每次1 h，过滤后合并滤液，浓缩至浓度为3 g/mL，取3 g/mL醇提取液20 mL稀释为1 g/mL，备用。

1.2实验方法

1.2.1菌液的制备 所有的实验菌用哥伦比亚血琼脂平板于35 ℃下培养18～24 h，生长菌落用无菌生理盐水分别稀释成1.5×108CFU/mL( 0.5麦氏单位)、1×107CFU/mL、1×103CFU/mL，备用。

1.2.2含药纸片的制备 分别取20 μL浓度为3 g/mL白花九里明水、醇提取物加入到直径6 mm无菌纸片中，备用。纸片含药量为0.06 g。

1.2.3抑菌圈的测定 采用纸片扩散法[5]用无菌棉拭蘸取0.5麦氏单位各实验菌菌液，在试管壁上挤压几次压去多余菌液，均匀涂布接种于整个MH平板。将含药纸片贴于已接种实验菌的MH平板上,轻压纸片使其贴平,直径90 mm平皿等距离贴6张纸片。氨曲南(30 μg/纸片)作耐药对照，利奈唑胺(30 μg/纸片)作敏感对照。放置于35 ℃恒温箱培养24 h后,取出用游标卡尺测量各抑菌圈的直径。

1.2.4最小抑菌浓度(MIC)的测定[5-6]采用肉汤稀释法进行。肉汤稀释法中药提取液由于颜色太深, 难于直观判定，因此在1 000 mL MHB 中加入3 g葡萄糖、0.4%酚红溶液6 mL做指示剂，成为葡萄糖酚红MHB。取160支灭菌带胶塞试管,每10支为一组编号，每支试管内(除每排第一管外)分别加入葡萄糖酚红MHB 2.0 mL。每排第1、第2管分别加入1 g/mL壮药白花九里明水提、醇提药液2.0 mL,药液从第2管起做二倍递减浓度稀释(即1～8号试管内药物浓度依次为1.0，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 5，0.016，0.008 g/mL) 。在1～8号试管每管分别加入1×107CFU/mL菌液0.1 mL,第9号试管加壮药白花九里明水提或醇提药液2 mL,不加菌液,作为对照,观察药物是否污染,第10号试管加葡萄糖酚红MHB 2.0 mL和1×107CFU/mL菌液0.1 mL,作为细菌对照,观察细菌是否正常生长。然后将实验管和对照管置35 ℃培养18～24 h后取出, 观察并判定药物对各菌株的MIC。

1.2.6MRSA菌株鉴定 采用Vitek2Compact全自动细菌鉴定仪进行细菌鉴定及药敏试验，药敏结果根据2012美国临床实验室标准委员会(CLSI)标准[7]判断。以苯唑西林MIC≥4判定为MRSA。

2 结 果

2.1抑菌圈测定结果 根据《药理实验方法学》[8]标准判定，抑菌圈直径<10 mm为抗药，10 mm为轻度敏感，11～15 mm为中度敏感，>16 mm为高度敏感。壮药白花九里明水提取物抑菌圈直径18～24 mm，醇提取物抑菌圈直径11～18 mm。醇提物对MRSA有中度抑菌作用，水提取物对MRSA有强抑菌作用。各菌株抑菌圈测定结果见表1。

表1 壮药白花九里明提取物对MRSA的抑菌圈直径 mm

2.2MIC、BC测定结果 壮药白花九里明提取物具有体外抗菌活性，水提取物对MRSA的MIC为31.25～250 mg/mL 、MBC为31.25～250 mg/mL，醇提取物对MRSA的MIC为31.25～250 mg/mL、MBC为62.5～500 mg/mL。见表2。

3 讨 论

人类很多严重的细菌感染性疾病使用了抗菌药物而得到有效的控制。但是,因为抗菌药物使用的不合理导致了耐药菌株的增加,大大降低了现有抗菌药物的治疗效果,严重地威胁着人类的健康。2012年中国CHMET细菌耐药性监测结果表明，MRSA耐药率为47.9%，根据CLISL解释标准，对具有抗MRSA活性的内酰胺酶类药物试验结果报告耐药的MRSA严重感染可采用万古霉素，但由于万古霉素对肝肾功能的损害大而影响治疗的选择。如何延缓耐药菌株的生成、避免不良反应以及研究新的抗菌药物已成为21世纪医药学界重要的课题。医药学家在努力开发抗菌谱更广、作用更强和不良反应更少的新抗菌药物,可越来越多的证据表明，细菌产生耐药的速度已超过新药研发的速度,一般新的抗菌药物从研发到上市的周期长达10年，而细菌产生耐药的时间仅要2年，何况研制一个新抗菌药物的成本非常大。几千年来中药为中国人民的健康作出了重大贡献,在现代防控细菌性感染疾病等方面都发挥了积极的作用。由于中药包括民族药的特殊性,细菌较少对其产生耐药性，而且其来源广、费用低廉、不良反应少。因此,研究和开发抗菌中华传统民族药对解决耐药菌株的产生和抗菌药物短缺和避免严重不良反应等问题都具有非常重要的意义。

表2 壮药白花九里明提取物对MRSA的MIC、MBC mg/mL

本次实验所用MRSA都是从临床感染患者中分离的对抗生素有不同程度耐药的菌株，对长期大量使用抗菌药和久治不愈的重症感染患者具有很大的威胁，而本次实验壮药白花九里明水、醇提取物对MRSA临床菌株表现出较好的体外抗菌作用，该结果为壮药白花九里明抗菌作用提供实验依据,为合理使用壮药白花九里明奠定了实验基础。壮药白花九里明水、醇提取物对MRSA抑菌实验结果表明，水提取物抗菌作用强于醇提取物，说明壮药白花九里明对MRSA抑菌成分存在于水溶性部分，具体活性成分分析、分离、提纯还有待于进一步研究。

壮药白花九里明广泛分布于广西、云南、四川、贵州、广东、湖南南部、江西南部、福建及台湾等省区[9]，是广西民间常用药材，味苦、微辛，性凉，具有清热明目、祛风止痒、解毒消肿作用。主治目赤肿痛，翳膜遮睛，风疹、疥疮、皮肤瘙痒、痈肿疮疖、跌打红肿等[10]。还具有清热解毒功效，可治疗产后出血和继发细菌感染[11]等症，与抗菌作用实验是吻合的。治疗感染性疾病方面单味中药也发挥了重要作用。苏镜如等[12]对广西梧州产广藿香全草中的精油成分及其抗菌活性进行了研究,结果表明,广藿香精油对新型隐球菌、球毛壳菌和短柄帚菌的生长抑制比较显著，对白葡萄球菌、枯草杆菌、四联球菌、金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用。有的中药除自身具有抗菌作用外,在与某些抗菌药物合用时还可起到协同作用。双黄连粉针是由金银花、黄芩、连翘等制成的天然药物注射剂,具有抗病毒及抗菌作用,临床常用于治疗肺炎、上呼吸道感染等多种疾病,常分别与多种抗生素配伍使用。实验观察了该药与青霉素G,头孢唑啉,头孢噻肟钠,妥布霉素伍用时体外抗菌作用、细菌清除率和比较肺炎病人单用及合用时体内血药浓度与临床疗效的相关性,结果双黄连粉针与这四种抗生素伍用具有较好的安全性,可显著增强抗感染的效果,与单用以上抗生素比较差异有统计学意义,体内外结果相似[13]。

筛选出活性较好的纯天然民族药进一步分离提纯并与抗菌药物联合，进行体外、体内抗菌实验，选择有协同作用的抗菌药物开发并在临床使用，可以达到更好的治疗效果。本研究只测定壮药白花九里明对MRSA的体外抗菌作用,而这一抗耐药菌作用明显，用途广泛，分布广阔的植物资源，对其他菌和多重耐药菌的体外、体内作用、有效成分和作用机制、急性毒性等非常值得进一步深入研究和开发。

[1] 宋世平，解晓珍，席道友，等. 158株金黄色葡萄球菌的耐药性监测与分析[J]. 中华医院感染学杂志，2003，13(4):384-385

[2] Rice L. Antimicrobial resistance in gram positive bacteria[J]. Am J Infect Control，2006，34(5 Suppl1):S11-19;discussion S64-S73

[3] Dreww RH，Perfect K，Smith L，et al. Treatment of methicillin resistant Staphylococcus aureus infections with quinupristin/dalfopritin in patients intolerant or failing prior therapy[J]. Antimicrob Chemother，2000，46(3):775-778

[4] 李娟,李晓东,杨丽霞,等. 单味中药体外抑菌活性的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志,2011,17(11):283-286

[5] 周庭银. 临床微生物诊断与图解[M]. 上海：上海科学技术出版社，2007：34-37

[6] 冯秀丽,许庆华，赵晓云,等. 金银花及其复方的体外抑菌活性与体内抗炎作用[J]. 沈阳药科大学学报,2013,30(1):35-39

[7] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Twenty-second informational supplement．CLSI，Wayne，PA,2012：M100-S22

[8] 徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京: 人民卫生出版社，2002:1647-1653

[9] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志[M]. 北京：科学出版社， 1979：11

[10] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草[M]. 上海：上海科学技术出版社，1998：743

[11] 方鼎. 壮族民间用药选编[M]. 南宁：广西民族出版社，1985：74-75

[12] 苏镜如,张广文,李核,等. 广藿香精油化学成分分析与抗菌活性研究(I)[J]. 中草药,2007,32(3):2041

[13] 林彬,李仲昆,黄惠珍,等. 黄连粉针与4种抗生素的伍用[J]. 中国药房,2000,9(4):1711

Study on the antibacterial effect in vitro of against methicillin-resistant Staphylococcus aureus of extractive Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng

NING Tian1, HUANG Weizhen2, LI Junfang3, ZHANG Qing2, LIANG Hong1, LE Ning3, ZHAO Xiaojie3, NING Xiaoqing3

(1.Guangxi Health Vocational & Technical College, Nanning 530023, Guangxi, China; 2.Guangxi Maternal and Child Health Hospital/Guangxi Maternity Hospital, Nanning 530003, Guangxi, China; 3.College of Pharmacy of Guangxi University of TCM,Nanning 530001, Guangxi, China)

Objective It is to explore the antibacterial effect of water, alcohol extract of extractive Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vi-tro, thus to provide a new way for the clinical treatment of MRSA infection. Methods Water, alcoholextraction of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng was prepared, ant-ibacterial experiment in vitro against Strains of methicillin-resistant Staphylococcus a-ureus isolated from clinic was performed on by the conventional agar diffusion method, minimum inhibitory conc-entration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) were determined by double dilution method. Results Bacteriostatic circle diameter of water extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng was 18-24 mm, and that of alcohol extract was 11-18 mm, MIC of water extract was 31.25-250 mg/mL, MBC was 31.25-250 mg/mL, MIC of alcohol extract was 31.25-250 mg/mL, its MBC was 62.5-500 mg/mL. Conclusion Water, alcohol extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng have good inhibitory effect against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains.

Blumeu megucephala(Randeria) chamg et Tseng; MRSA; MIC; MBC; antibacterial experiment in vitro

宁天，男，教授，在职研究生，主要从事药理学教学与科研工作。

宁小清，E-mail：1043304247@qq.com

广西卫生厅自筹经费科研课题(Z2013151)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.05.002

R961

A

1008-8849(2015)05-0460-03

2014-07-30