张海燕，王 捷，冼 江(广州军区广州总医院医学实验科，广州 510010)



·论 著·

琼脂糖电泳中核酸染料Genefinder的最佳使用方法建立

张海燕，王 捷△，冼 江
(广州军区广州总医院医学实验科，广州 510010)

目的 确定琼脂糖凝胶电泳中使用核酸染料Genefinder的最适方法，以期找到染色效果理想的染色方法。方法 在琼脂糖凝胶电泳中，采用预染样品法、胶内染色法以及两者相结合的3种方法，使用核酸染料Genefinder进行染色，对染色结果进行比较分析。结果 使用胶内染色法染色效果较好，预染样品法次之，胶染及样品染色法结合效果最差。结论 核酸染料Genefinder会影响DNA的迁移效率，使用Genefinder进行胶内染色是一种较好的染色方法。

Genefinder； 样品预染法染色； 胶内染色

溴化乙锭(EB)曾是琼脂糖凝胶电泳中最为常用的核酸染料,被广泛应用于观察、检测DNA/RNA。但作为一种强诱变剂,EB可插入核酸相邻碱基平面之间，引起基因突变，具有中等毒性，对人体有潜在的危害性[1-3]。Genefinder是一种新型核酸染料，与强致癌性的EB不同，Genefinder属于花青类染料，毒性低，使用安全,可以代替EB作为各种核酸电泳的染色剂。那么,新型核酸染料是预染样品法、胶内染色法还是两者相结合的染色方法检测灵敏度最高,最实用呢?本文在3种染色方式下使用Genefinder核酸染料对凝胶中的DNA进行染色，对染色结果进行比较分析,为实验中选择合适的Genefinder染色方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 实验使用的核酸样品为本实验室扩增获得的EGFR基因20号外显子的PCR产物(约110 bp)。

1.1.2 试剂 核酸染料Genefinder(10 000×) (百维信生物科技有限公司)；6×loading buffer[宝生物工程(大连) 有限公司]；DNA Marker DL2000[宝生物工程(大连) 有限公司]；琼脂糖胶Agarose gels(Oxoid,England)。

1.1.3 仪器 蓝盾552可见光凝胶电泳透射仪(百维信生物科技有限公司，厦门)，621蓝盾可见光透射仪(百维信生物科技有限公司，厦门)，微量移液器(eppendorf，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 胶染法 配制1.5%的琼脂糖溶液，加热溶解，冷却至60 ℃左右，按比例加入10 000×Genefinder染料，使染料在胶中的终浓度为1×(即如果制备50 mL 凝胶，加入5 μL的10 000×Genefinder染料),然后倒胶。待凝胶液冷却凝固后，加入DL2000 核酸标准物及PCR产物进行电泳。使用5 V/cm 的电压进行电泳，最后用621蓝盾可见光透射仪进行观察拍照。

1.2.2 预染样品法 按照常规方法配制1.5%琼脂糖凝胶，制胶过程中不加入Genefinder染料。配制loading buffer预染液:将10 000×Genefinder染料和6×loading buffer按照1∶9的比例混合(如5 μL染料和45 μL的6×loading buffer混合)。将需要进行电泳检测的PCR产物及DL2000 核酸标准物与配置好的loading buffer预染液按照5∶1混合，室温静置3 min后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压5 V/cm，电泳结果用621蓝盾可见光透射仪进行观察拍照。

1.2.3 胶染法+预染样品法 配制1.5%的琼脂糖溶液，加热溶解，冷却至60 ℃左右，按比例加入10 000×Genefinder染料，使染料在胶中的终浓度为1×Genefinder染料,然后倒胶。将需要进行电泳检测的PCR产物及DL2000 核酸标准物与配置好的loading buffer预染液按照5∶1混合，室温静置3 min后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压5 V/cm，电泳结果用621蓝盾可见光透射仪进行观察拍照。

2 结 果

3种染色方法电泳后进行染色效果的比较，见图1～3。图3中电泳条带模糊、不整齐，且有较明显的拖尾现象，DL2000 MARK 中分子大小不同的DNA片段不能清晰分辨；图2中条带模糊的问题稍有改善，DNA样品仍有少量的拖尾现象，DL2000 MARK 中分子大小不同的DNA片段能进行区分，但清晰度不佳；图1的染色效果明显比前两者染色的效果好得多，结果中核酸分子的条带清晰、整齐，背景低，信噪比相对高，条带边缘锐利，便于显示实验结果(图1)。电泳中使用的核酸样品是同一批样品，但是比较胶法染色(图1)、预染样品法染色(图2)及两者相结合的染色方法(图3)，发现3种方法显示的核酸分子的大小不完全一致。这可能是样品加入染料后，影响了样品的迁移速率，以致不能准确地判断DNA条带的大小。

注：M为DL2000 Marker；泳道1、2、3为核酸样品。

图1 胶染法染色

注：M为DL2000 Marker；泳道1、2、3为核酸样品。

图2 预染样品法染色

注：M为DL2000 Marker；泳道1、2、3为核酸样品。

图3 胶染法+预染样品法

3 讨 论

EB因其在核酸电泳中有着条带边缘清晰、背景低、灵敏度高的优点，曾经是实验室用于检测核酸的常规染料。但由于EB是一种强诱变剂并具有一定的致癌性而逐渐减少使用。Genefinder 是近几年推出的新型荧光核酸染料，属于花青类染料，毒性低，使用安全，可有效保护操作者和环境。Genefinder与核酸结合后的最大吸收峰为490 nm,与染料结合的核酸在紫外线下呈现绿色荧光。但该染料同样能引起有机体突变，在使用时要采取适当的保护措施[4-6]。有报道表明，新型荧光核酸染料在成本、灵敏度、安全性方面都具有较大优势，适合实验室的常规核酸检测，可以作为EB的替代品[7]。但是，不同的染色方式下，检测效果有很大差异，通过比较图1～3可以看出，使用胶染法染色Genefinder 对100～2 000 bp的核酸分子，其显色效果条带清晰，平直，边缘整齐；预染样品法和两者相结合的染色方法都会导致核酸条带模糊拖尾及DNA MARK分辨率不高的现象。这个结果与刘阳等[8]的研究结果是一致的，不论是对于EB还是新型核酸染料，使用胶染法的灵敏度较高。此外，在实验过程中还发现，当Genefinder在上样前与DNA混匀后再电泳时,DNA片段的电泳迁移率会有一定程度的降低,因此,不能用于准确地判断DNA条带的大小,只适用于简单的电泳试验，如胶回收、简单PCR产物分析等。上述结果提示,对于PCR产物而言,条带大小的不同可能是PCR产物的大小不同或同一PCR产物的染料浓度不同所致[8-10]。

综上所述，Genefinder 是花青素类的染料，安全、环保，灵敏度高，对琼脂糖凝胶中的DNA/RNA 进行染色，可以作为EB的替代品用于实验室的常规检测；在实验条件相同的情况下，使用胶染法进行染色可以得到清晰整齐的染色条带，与预染样品法及胶染法+预染样品法相比较，是比较理想的染色方式，而且可以减少电泳中Genefinder对核酸迁移率的影响。

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Establishment of optimal use method of nucleic acid dyes Genefinder in agarose gel electrophoresis

ZHANGHai-yan,WANGJie△,XIANJiang
(DepartmentofMedicalEperiment,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Guangzhou,Guangdong510010,China)

Objective To determine a optimal method for using nucleic acid dyes Genefinder in agarose gel electrophoresis in order to find out a staining method with ideal dyeing effect.Methods The pre-dyeing sample method,gel staining method and their combination staining method were adopted to perform the staining with nucleic acid dyes in agarose gel electrophoresis.The staining results were performed the comparative analysis.Results The Genefinder staining had better effect，the pre-dyeing sample method took the second place and the combination staining method had the worst effect.Conclusion Nucleic acid dyes Genefinder has an effect on the mobility of nucleic acid in agarose gel electrophoresis,therefore staining nucleic acid with Genefinder is a better staining method in agarose gel electrophoresis.

Genefinder; staining with preparative dye liquor; staining in agarose gel electrophoresis

张海燕，女，主管技师，博士，主要从事肿瘤分子病理诊断研究。△

，E-mail:jiew@tom.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.020

A

1672-9455(2015)21-3184-02

2015-02-15

2015-07-06)