厉 倩,龙安雄,姜连生,蔡雷鸣,谢 骊,顾继安,谭龙益

(上海市第一人民医院宝山分院检验科 200940)



·论 著·

子痫前期患者血清微小RNAs的差异表达研究

厉 倩,龙安雄,姜连生,蔡雷鸣,谢 骊,顾继安,谭龙益△

(上海市第一人民医院宝山分院检验科 200940)

目的 探讨子痫前期患者血清微小RNAs(miRNAs)不同的表达水平，分析子痫前期相关标志物。方法 选择10个子痫前期患者胎盘中差异表达的miRNA，分别收集该院30例子痫前期患者和30例正常妊娠孕妇孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血清miRNAs，采用SYBR Green qRT-PCR法检测血清中10个miRNAs的表达量。结果 子痫前期胎盘中高表达的3个miRNAs(miR-152、miR-183、miR-210)在子痫前期孕中、晚期血清中表达显著升高，而胎盘中高表达的miR-182仅在子痫前期孕晚期表达显著升高；子痫前期胎盘中低表达的6个miRNAs(miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584)在子痫前期各个孕期的表达，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-152、miR-183、miR-210在子痫前期孕中、晚期血清中表达显著升高，可能是预测子痫前期发生的良好生物标志物。

子痫前期； miRNAs； 血清; 生物标志物

子痫前期(PE)是一种常见的孕妇多系统紊乱综合征，是孕妇和胎儿发病率(5%)和病死率最高的疾病之一，全球每年大约800万人受到影响，7万孕妇病死[1]。其主要表现为在怀孕20周后出现高血压和蛋白尿，部分患者出现水肿、头痛，严重者发生子痫、肝肾功能和凝血障碍，成人呼吸窘迫综合征和胎儿发育障碍等，发生过子痫的孕妇其后患高血压、心血管疾病的风险概率也增加。胎儿分娩和胎盘剥离是目前唯一的治疗手段，但早期对高危孕妇进行干预，可减少子痫的发生及减轻危害，具有一定的临床价值。

子痫前期的病因和病理学机制尚不清楚，且缺乏较理想的早期诊断指标[2]。有研究报道在子痫前期胎盘中发现了异常表达的微小RNAs(miRNAs，miRNAs)，这为该研究开辟了一个新方向[3]。目前的相关研究表明miRNAs与子痫前期的发生密切相关，已发现多个与子痫前期有关的差异表达miRNAs，但多数都是在胎盘中进行检测[3-5]。现通过检测子痫前期患者不同孕周外周血miRNAs，分析某变化规律，探讨miRNAs作为子痫前期预测因子的临床价值。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年1月至2013年12月该院分娩的30例PE患者(病例组)和30例正常妊娠产妇(对照组)。PE诊断标准依据妇产科学(第7版)[3]，即妊娠20周后收缩压大于或等于140 mm Hg和(或)舒张压大于或等于90 mm Hg，伴蛋白尿大于或等于0.3 g/24 h，或随机蛋白尿阳性。所有研究对象都是单胎妊娠，对照组和病例组的年龄、孕前体质量指数(BMI)等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。收集对照组孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血清30例，收集病例组孕早期血清14例、孕中期30例、孕晚期30例。见表1。

表1 2组研究对象临床资料结果比较

1.2 样本采集、处理及保存 采用分离胶真空采血管采集空腹血样3～5 mL，静置20 min后离心，1 200 r/min，离心10 min。首次离心后收集上清液并高速(12 000 r/min)离心10 min，置上清液于无RNA酶的无菌Eppendorf管中，-80 ℃冻存备用。

1.3 RNA抽提 使用miRNeasy Serum/Plasma kit(德国Qiagen公司)提取血清总RNA，严格按照说明书进行操作：200 μL血清加入1 mL Qiazol溶解液，充分混匀，室温放置5 min，加入3.5 μL的Cel miR-39(1.6～108/μL,Qiagen)作为RNA抽提质量指标，然后加入200 μL的氯仿，充分混匀，室温放置3 min,后置于低温离心机(美国Sigma公司)内12 000 r/min离心15 min，将550 μL上层澄清萃取液转移到新的1.5 mL无菌Eppendorf管中，加入1.5倍(825 μL)的无水乙醇，充分混匀，分2次将混合液过洗脱柱，弃去滤过液，洗脱柱分别用700 μL RWT、RPE缓冲液和80%乙醇溶液洗涤，末次洗涤后洗脱柱高速(12 000 r/min)离心5 min以干燥柱内膜，最后加入14 μL无RNA酶水洗脱总RNA。

1.4 cDNA第1链合成 应用miScript Ⅱ逆转录试剂盒(德国Qiagen)合成cDNA第1链(加尾法)，操作步骤：150 μL PCR反应管中加入2 μL 10×RT mix，2 μL 10×nucleics mix，8 μL无RNA酶水，4 μL 5×hispec Buffer和4 μL总RNA，充分混匀并低速(1 200 r/min)离心1 min后置于扩增仪(Bioer)中，36 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。

1.5 荧光定量PCR 采用miScirpt SYBR green PCR 试剂盒(德国Qiagen公司)和ABI 7500扩增仪(美国ABI公司)进行荧光实时定量。反应体系：10 μL 2×master mix，2 μL 10×通用引物，2 μL 10×特异性引物，4 μL 无RNA酶水和2 μL 100倍稀释的cDNA模板。扩增条件：95 ℃变性15 min，循环条件94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 34 s，延伸阶段采集荧光信号，共40个循环。内参基因为血清中稳定存在的miR-16。目标miRNA，miR-16和Cel miR-39分别在不同的反应孔中进行扩增。所有荧光定量PCR反应在96孔反应板内进行。使用SDS1.3(Applied Biosystems)软件分析Ct值，每个标本都做3个平行复孔，取Ct平均值。将目标miRNAs的平均Ct值减去内参miR-16 Ct值作为ΔCt值，ΔCt值越低，则表达水平越高，计算标准化后的2-ΔΔCt值表示miRNA的组间表达倍数变化。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，组间两两比较使用Student′st检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外周血清 miRNAs的检测结果比较 各组血清中均能检测到Cel miR-39、miR-16及 10种目标miRNAs，其中Cel miR-39在各组中的含量非常稳定，说明实验中的RNA抽提、逆转录和扩增条件控制较好，miR-16在各组的表达量稳定，表明miR-16可作为内参基因。见表2。

2.2 血清中10种miRNAs在不同孕期的表达量比较 与正常妊娠同孕期比较，PE患者孕早期(12～14周)血清中10种miRNAs的表达量，差异无统计学意义(P>0.05)，PE患者孕中期(20～24周)miR-152、miR-183、miR-210的表达量升高，PE患者孕晚期(28～32周)miR-152、miR-182、miR-183、miR-210的表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 血清中12种miRNAs的检测结果比较

表3 血清中10种miRNAs的表达量结果比较

2.3 PE患者妊娠中、晚期miR-152、miR-182、miR-183、miR-210与正常妊娠表达倍数变化 miR-152、miR-183、miR-210在妊娠中期PE患者血清中的表达分别为正常妊娠的5.28、12.99、11.1倍，而miR-182在妊娠晚期PE患者血清中的表达为正常妊娠的3.73倍。见表4。

表4 2组研究对象表达升高的miRNAs的倍数值 (相对倍数变化，2-ΔΔCt)

3 讨 论

miRNAs是一类全长为19～25个核糖核苷酸的非编码调控单链小分子RNA,由一段具有发卡环结构的单链RNA前体剪切后生成,通过与目标mRNA分子的3′端非编码区域(3′UTR)互补配对使目标mRNA分子的翻译受到抑制，从而在转录后对靶基因的表达水平进行调控[6]。生物信息分析显示，只占人类基因组1%～3%的miRNA调控着高达30%的人类基因。近年来的研究表明miRNA在细胞增殖、分化、凋亡，肿瘤形成，心血管疾病等生理和病理过程中都起非常重要的作用。

miRNAs不仅存在于组织细胞中，在血浆或血清中也非常稳定，这为miRNAs进行临床疾病研究提供了依据[7]。Gilad等[7]发现采用qRT-PCR技术可对人体的尿液、唾液、羊水及胸水miRNAs进行定量，这些体液中的miRNAs表达异常可能预示机体功能的改变。已有多项研究显示血清miRNAs表达谱与多种肿瘤相关，可能在肿瘤的诊断及预后判断方面具有重要价值。

目前多数文献报道PE胎盘中异常表达的miRNAs，有关血清miRNAs表达谱与子痫前期的关系尚未明确。本组通过分析2001～2011年PubMed数据库文献，确定10个在2个或2个以上研究中均表明在胎盘组织中表达上调或下调的miRNAs，其中表达上调的是miR-210、miR-182、miR-183、miR-152，表达下调的是miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584，使用SYBR Green qRT-PCR技术检测PE患者不同孕期血清中10个miRNAs的表达水平。

与胎盘中的miRNAs研究结果相一致[3-5]。PE患者孕晚期血清中miR-210、miR-182、miR-183、miR-152的表达均高于正常妊娠者，其中miR-210、miR-183、miR-152在孕中期即已经高于正常妊娠者，提示孕中期miR-210、miR-182、miR-152可作为PE的风险预测因子。PE患者血清中miR-210表达升高已有报道[8]。而miR-182、miR-183、miR-152在PE患者血清中表达升高尚未见相关报道。胎盘中升高的miRNAs可能通过外排体(exosome)的形式分泌到血液中，进而影响到血清、血浆miRNA表达谱。

与正常妊娠者比较，miR-1、miR-328、miR-363、miR-377、miR-500、miR-584在胎盘研究中表达下调的miRNAs，在PE患者血清中的表达,差异无统计学意义(P>0.05)，这可能是受到了其他目前未知的干扰因素影响，因为这些miRNAs不是胎盘的特异性，其他组织、细胞也可能分泌。Yang 等[9]应用下一代测序技术比较了2例PE重度、2例PE轻度和1例正常妊娠孕妇在分娩前血清miRNAs表达谱，结果只发现3个与其他胎盘miRNAs表达谱研究报道一致的结果，这可能是因为血清受到其他更多干扰因素的影响，胎盘与血清中的结果并不总是正相关。胎盘特异性miRNAs由于只在胎盘组织表达，其在胎盘组织和外周血中的相关性可能会更好，这可能是未来外周血PE相关miRNAs的研究热点[10-11]。

综上所述，本研究结果表明，PE患者孕中期miR-210、miR-183、miR-152表达升高，并维持至孕晚期，miR-182在PE孕晚期表达升高，提示miR-210、miR-183、miR-152可能是预测子痫前期发生的良好生物标志物。

[1]Pennington KA,Schlitt JM,Jackson DL,et al.Preeclampsia:multiple approaches for a multifactorial disease[J].Dis Model Mech,2012,5(1):9-18.

[2]Young BC,Levine RJ,Karumanchi SA.Pathogenesis of preeclampsia[J].Annu Rev Pathol,2010,10(5):173-192.

[3]Pineles BL,Romero R,Montenegro D,et al.Distinct subsets of miRNAs are expressed differentially in the human placentas of patients with preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol,2007,196(261):156-160.

[4]Zhu XM,Han T,Sargent IL,et al.Differential expression profile of miRNAs in human placentas from preeclamptic pregnancies vs normal pregnancies[J].Am J Obstet Gynecol,2009,200(54):6611-6617.

[5]Enquobahrie DA,Abetew DF,Sorensen TK.Placental miRNAs expression in pregnancies complicated by preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol,2011,204(178):8812-8821.

[6]Kloosterman WP,Plasterk HA.The diverse functions of miRNAs in animal development and disease[J].Dev Cell,2006,11(4):441-450.

[7]Gilad S,Meiri E,Yogev Y,et al.Serum miRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoS ONE,2008,3(9):31-48.

[8]Zhang Y,Fei M,Xue G,et al.Elevated levels of hypoxia-inducible miRNAs-210 in pre-eclampsia:new insights into molecular mechanisms for the disease[J].J Cell Mol Med,2012,16(2):249-259.

[9]Yang Q,Lu J,Wang S,et al.Application of next-generation sequencing technology to profile the circulating miRNAs in the serum of preeclampsia versus normal pregnant women[J].Clin Chim Acta,2011,412(24):2167-2173.

[10]Liang Y,Ridzon D,Wong L,et al.Characterization of miRNAs expression profiles in normal human tissues[J].BMC Genomics,2007,33(8):166-171.

[11]Hromadnikova I,Kotlabova K,Doucha J,et al.Absolute and relative quantification of placenta-specific micrornas in maternal circulation with placental insufficiency-related complications[J].J Mol Diagn,2012,14(2):160-167.

Study on the differential expression of microRNAs in the preeclampsia serum*

LIQian,LONGAn-xiong,JIANGLian-sheng,CAILei-ming,XIELi,GUJi′an,TANLong-yi△

(DepartmentofClinicalLaboratory,BaoshanBranchofShanghaiFirstPeople′sHospital,Shanghai200940,China)

Objective To study the differential expression of serum microRNAs in preeclampsia(PE) patients so as to find some serum biomarkers related to PE.Methods Ten microRNAs were selected according to their reported differential expression in PE placenta.30 PE patients and 30 normal pregnacy were recruited in the study.The expression of these 10 microRNAs in serum from the differnt trimesters were determined by SYBR Green quantitive reverse transcription-PCR(qRT-PCR).Results Compared with control,the expression of miR-152,miR-183,miR-210 were higher in both second and third trimester,the expression of miR-182 was only higher in third trimester.While the expression of 6 miRNAs were downregulated in PE plancenta,namely miR-1,miR-328,miR-363,miR-377,miR-500,miR-584,showed no significant difference between PE patients and normal pregnacy throughout the three trimesters.Conclusion The expression of serum miR-152,miR-183,miR-210 elevated since the second trimester,indicating their potential role as serum biomarkers for forcasting PE.

preeclampsia； microRNA； serum； biomarker

上海市宝山区科委科研项目(11-E-15)。

厉倩，女，硕士，主管技师，主要从事妊娠相关疾病的实验室诊断研究。△

，E-mail:sybspyl163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.013

A

1672-9455(2015)12-1692-03

2014-12-22

2015-02-18)