李效尊，杨百战，尹静静，杜绍印，崔太昌，吴修

（1.山东省水稻研究所/山东省农业科学院水生生物研究中心，济南，250100；2.郯城县种子公司）

莲（Nelumbo nuciferaGeartn.）又名水芙蓉、荷花、莲藕等，是莲科莲属多年生宿根性水生草本植物[1]。莲在我国广泛分布，且具有悠久的种植历史。莲全身是宝，兼有药用、食用和观赏价值。根据用途，莲可分为子莲、藕莲和花莲。莲籽是莲的种子，藕是莲膨大的根状茎，二者是莲藕主要的食用部分。莲藕是我国栽培面积最大的水生蔬菜[2]。

种质资源是开展遗传和育种研究的基础，是重要的战略资源。我国是开展莲藕种质资源和育种研究较多的国家。目前国家种质武汉水生蔬菜资源圃保存了莲藕种质资源600 余份，其中多数为我国南方地区莲藕种质资源，北方莲藕种质资源相对较少。

由于特殊的构造和生理特性，莲籽是寿命较长的少数植物种子（果实）之一。关于古莲籽的出土、长寿机制和利用研究报道已有不少[3，4]，古莲的出土为研究当地历史地理和旅游开发提供了重要素材，也为莲藕遗传育种研究提供了重要种质资源。2013 年，在梁山山体南侧平原水库的挖掘过程中，人们在距地面6.5 m 左右的泥炭层中发现了大量的莲籽，这些古莲籽经过培育成功成苗，将其命名为梁山古莲。为了充分挖掘梁山古莲的历史和生物学价值，利用碳同位素测定技术对出土莲籽进行了断代分析，并对其实生苗植株的生物学性状和遗传地位进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

梁山古莲籽取自山东梁山县平原水库（梁山山体南侧）施工现场距地面6.5 m 左右的泥炭层中。莲籽实生苗和无性系植株种于山东省农业科学院水生生物研究中心饮马泉基地。其他莲藕材料信息见表1。

琼脂糖、CTAB 购自上海生物工程股份有限公司；Taq 酶、RNase A 和DL2 000 DNA Marker 购 自Takara 公司；其他常规试剂购自国药集团化学试剂有限公司；引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。PCR 仪（型号为Mastercycler AG22331）和离心机（型号为Centrifuge 5424）由德国Eppendorf 公司生产；电泳仪（型号JY600C）和凝胶成像系统（型号为JY04S-3E）由北京君意东方电泳设备有限公司生产。

1.2 试验方法

表1 莲藕材料信息

碳素测定法，C 含量由西安加速器质谱中心测定。利用软件Calib 7.0.2 将14C 年龄校正到公元纪年[5]。共测3 个独立莲籽，分别取自不同方位。

②发芽率测试 莲籽有凹陷的一端破口后，浸种3 d，每天换水1 次。培养温度：白天30℃，夜间25℃；光照时间：白天16 h，夜间8 h，光照强度为12 000 lx。

③生物性状统计 将古莲实生苗种在8 m2的水泥池中，田间管理参照常规方法。通过对2 个古莲单株进行了2 a 的跟踪调查，记录开花期、株高、花茎、花色、叶片大小、藕的形状等[6]。

④聚类分析 为了揭示梁山古莲与山东周边野莲和藕莲地方品种之间的亲缘关系，利用RAPD 标记对其与一些代表性材料（表1）进行了聚类分析。莲藕DNA 提取和PCR 程序等参照尹静静等[7]的方法。

PCR 扩增完毕后， 统计群体中扩增清晰的RAPD 多态性条带，有条带记为“1”，无条带记为“0”。 用NTSYS 2.1 软件进行遗传相似性分析和UPGMA 聚类图的构建。

2 结果与分析

2.1 古莲籽断代结果

从表2 可以看出，梁山古莲籽埋入地下的时间距今最长约为731 a，最短约为598 a，此时为我国元朝至明朝初期。此结果证明，元朝之前梁山泊的确存在

2.2 古莲籽性状统计

从5 个不同的方位进行了样品收集，发现这些古莲籽表皮绝大部分均已失去，呈现出光亮的浅褐色，极少数莲籽尚残存不完整的柱头（图1）。测试了古莲籽的发芽率，发现其发芽率为90%～100%（表3）。统计了前3 个取样点莲籽的大小，发现第1 个取样点莲籽的长度（15.7 mm）和宽度（10.5 mm）明显大于另外两处（长度分别为14.9、14.5 mm；宽度分别为10.3、9.4 mm）（表3），说明古莲群体具有多样性。

2.3 古莲植株主要性状统计

于2013 年7 月种植了古莲籽，并于2014 年和2015 年对其无性株系进行了2 a 的跟踪调查。调查结果显示（表4），根据荷花分类标准[8]，梁山古莲株型达到了大株型标准（立叶高度50 cm 以上、叶径30 cm 以上、花径18 cm 以上），其花蕾为紫红色，花色为大红色，花瓣在20 枚以内（图2），藕皮色为白色，形状细长，与微山红莲和白洋淀红莲同属于中国莲系大株型少瓣红莲类群。梁山泊原属于黄河流域，梁山古莲可能是黄河流域比较有代表性的种质资源。同时，发现不同梁山古莲单株在大小上存在明显的差异，进一步说明群体内部存在多样性。

2.4 古莲与其他种质资源的亲缘关系

地方品种均是从野生资源中选育而来。为了解梁山古莲与周边野生资源和地方莲藕品种之间的亲缘关系，对相关材料进行了RAPD 分子标记聚类分析。结果显示（图3），梁山古莲与马踏湖白莲、微山红莲和白洋淀红莲亲缘关系较近，与马踏湖白莲关系最近，暗示梁山古莲可能为当地藕莲品种的来源。

3 结论与讨论

梁山因《水浒》而得名，是我国著名的旅游城市。但是，梁山泊作为历史存在和水浒故事的附着地一直因现实无水而备受争议。此次出土的莲籽最长距今700 余a，处于我国宋金元更替时期，这为历史上梁山泊的真实存在提供了有力的生物学证据。我国莲文化深厚，济南、济宁、澳门等城市把荷花作为市花，全国每年都有许多城市举办荷花节[9]。古莲作为一种奇特的资源，可以助推旅游业发展。辽宁普兰店就以古莲为名片，建立了千年古莲园等旅游景点，推动了当地旅游业发展。梁山可以借鉴普兰店的做法，利用梁山古莲发展相关旅游。

表2 梁山古莲籽断年结果

图1 梁山出土古莲籽形态

表3 梁山出土古莲籽性状

表4 梁山古莲植株主要性状

图2 梁山古莲开花期植株

图3 13 份莲藕材料UPMAG 聚类图

生物学性状分析表明，梁山古莲属于中国莲系大株型少瓣红莲类群[8]，应为我国黄河流域代表性的野莲资源。 历史记载，济南郊区曾出土过古莲籽[3]，但并没有被作为资源保存下来。此次梁山出土的莲籽成功培育出苗在黄河流域尚属首次。从出土莲籽及古莲植株的表型可以看出，古莲群体内有明显的多样性，暗示其遗传多样性比较丰富，可能蕴含一些重要的基因资源。更重要的是，我们发现梁山古莲与山东省地方品种马踏湖白莲亲缘关系较近，这为研究北方莲藕的驯化和开展育种研究提供了重要信息。

综上可见，梁山古莲是重要的种质资源，下一步将利用分子标记技术对古莲群体进行遗传多样性分析，并开展抗病等重要性状的评价和基因挖掘。

[1]陈耀东，马欣堂，杜玉芬，等.中国水生植物[M].郑州：河南科学技术出版社，2012：37-38.

[2]江解增，曹碚生.水生蔬菜品种类型及其产品利用[J].中国食物与营养，2005（9）：21-24.

[3]张义君.漫话古代莲[J].农业考古，1986（2）：256-266.

[4]田代科.古代莲故事[J].生命世界，2014（6）：10-11.

[5]Stuiver M,ReimerP J.Extended14C database and revised CALIB radiocarbon calibration program [J].Radiocarbon，1993,35:215-230.

[6]柯卫东，李峰，刘义满，等.NY/T1315-2007 农作物种质资源鉴定技术规程（莲）[S].

[7]尹静静，李效尊，阴筱，等.山东莲藕（Nelumbo nuciferaGaertn.）种质资源的RAPD 鉴定和遗传多样性分析[J].分子植物育种，2015，13（6）：1 323-1 328.

[8]王其超，张行言.中国荷花品种图志[M].北京：中国林业出版社，2004：63-66.

[9]王新悦.荷花产业向多元化、精品化转型[J].中国花卉园艺，2014（9）:32-35.